免疫双标,抗体如何选择?
注意几点:
1)最好是不同种属来源的一抗,而且最好都是单抗。
这样就要选择相应不同种属来源的二抗,避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。
选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。
好的抗体真的还是很重要。
2)如果条件所限,只找到一种抗体,而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办?
这个可能不是说就一定不能做,也可能是厂家没做这方面的实验,可以大胆的try
3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主?
一方面是不同抗体标记不同的荧光,图片漂亮;另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。
4)是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做?
可以做,过程还可省一步。但是注意没有二抗的放大效应,结果可能有时很难出来。
5)免疫双标荧光的图像如何整合?
可以用扫描共聚焦,或者用园子的软件整合。注意及时照相,荧光过段时间会淬灭。
免疫双标中,最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配:
1. 免疫双标做得好的基本原则是:一抗种属不同,二抗匹配对应的一抗,二抗不同颜色标记,二抗之间无交叉反应
2. 抗体的选择 一般根据本实验相关的一些关键词(抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...)来检索一些档次较高的文献,看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体,不见得知名公司的抗体就一定做得出来,实践检验过了的才是金标准。
3. 封闭液的选择 封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。所以,封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。比如,二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”,那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。免疫双标一抗的选择主要有两种形式:
第一:一抗种属来源相同:即一抗A和B都是小鼠抗大鼠,或者都是兔抗大鼠;
对于这种情况,采用的双标方法是顺序法,即把免疫组化的过程走两遍,一抗不能同时加。
第二:一抗种属来源不同:比如一抗A是小鼠抗大鼠,一抗B是兔抗大鼠,即A的种属来源是小鼠,B的种属来源是兔;针对的组织是大鼠。
对于这种情况,就可以两种一抗一起加了,减少了步骤,避免了很多麻烦。
之所以这样做,主要就在于二抗的选择上:
对于第一种情况,二抗只能选择抗小鼠的,或者都是抗兔的,如果同时加,就会出现交叉反应,得到不可靠的结果。
对于第二种情况,二抗选择就可以分为抗小鼠和抗兔,这样的话,抗小鼠的二抗就只能跟小鼠抗的一抗A结合,抗兔的二抗就只能跟兔抗的一抗B结合了,避免了交叉反应。
二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择问题:
问题1
组织:大鼠
一抗:A(小鼠抗大鼠),B(兔抗大鼠)
二抗:A(?羊抗小鼠),B(羊抗兔)
请问:二抗这样选择是否可行,为什么?
回答:这种是最常见的,也是最简单易行的。此时做荧光双标较理想,如二抗A选择羊抗小鼠的Cy2 (绿光), 二抗B选择羊抗兔的Cy3 (红光)。一般来说,此种情况下,两个一抗可以一起孵育,两个二抗也可以一起孵育。
封闭液就选择针对二抗的羊血清。一般是用10% normal goat serum 30min 37度。这种情况 选 羊的 或者驴血清 都可以。
问题2
组织:大鼠
一抗:A(小鼠抗大鼠),B(兔抗大鼠)
二抗:A(?羊抗小鼠),B(驴抗兔)
请问:此时的封闭血清该如何选择?
回答:选择BSA,但是BSA也不是万能的,但是不能选择大鼠血清。
如果组织变成小鼠,又是什么情况呢?
问题3
组织:小鼠
一抗:A(小鼠抗小鼠),B(兔抗小鼠)
二抗:A(?羊抗小鼠),B(羊抗兔)
请问:二抗这样选择是否可行,为什么?你是如何理解和处理小鼠抗小鼠的?
问题4
组织:小鼠
一抗:A(小鼠抗小鼠),B(兔抗小鼠)
二抗:A(?羊抗小鼠),B(驴抗兔)
请问:此时的封闭血清该如何选择?你是如何理解和处理小鼠抗小鼠的?