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  • 二抗—免疫荧光(IF)双标/多标实验的最佳选择

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:3939

      在免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验中,通常会在同一组织细胞标本上同时检测两种抗原,因而进行双重荧光染色(直接法和间接法)。一般来说,直接法简便可靠,但灵敏度较低,而且抗体来源较少;因此,大部分人会选择间接免疫荧光法:先用两种不同种属来源的特异性一抗孵育,再用对应的不同荧光素标记的二抗孵育,从而在荧光显微镜下观测。

      在免疫荧光实验中,有时候也需要同时对两个或多个目标蛋白进行共定位。此时,可以选择两个带有不同荧光颜色标记的一抗;然而,在更多的情况下,需要通过两到三种不同种属来源的未标记一抗,再配合两到三种带不同荧光标记的二抗以实现IF 双标或三标。那么该如何选择合适的免疫双标/多标实验的二抗?

      首先需要考虑荧光颜色的选择

      红色和绿色是最常见的两种荧光选择,绿色如FITC、Cy2或新一代Dylight 488等荧光染料;橙色如TRITC、Cy3 等荧光染料,而Texas Red则显示红色,Cy5、Cy7、APC或新一代荧光染料Dylight 649等则提供了深红色显示方案。目前IF双标一般优先选择红色和绿色;如果是三标,则第三种颜色选择蓝色,如AMCA 或者新一代Dylight 350、Dylight 405等。IFkine?系列荧光二抗来自于最新一代的荧光标记基团,在荧光强度、信噪比以及荧光的耐淬灭性上远远由于通用的FITC、TRITC、罗丹明等常规荧光基团的优势,同时具有接近或优于第二代荧光染料Alexa Flour和Dylight的荧光表现。其IFkine? Green提供绿色标记方案,IFkine? Green则是Cy3和罗丹明的卓越替代物,IFkine? Red则为Texas Red提供更优越的红色荧光方案。该系列荧光团具有更高的荧光强度、更低的背景、更佳的抗淬灭性以及优异的性价比。

      另外二抗的类型对IF双标/多标也有莫大的影响

      在免疫荧光双标或多标时,首先样本本身的复杂条件可能会产生与二抗的非特异性杂交;另外,由于同时有两个一抗分子,因此一抗与二抗之间也有一定的非特异性结合。IFkine?系列荧光二抗经过特别优化,其针对目的种属的特异性非常高,同时针对其他非目的种属的抗体分子的非特异性结合降到最低,同时避免了二抗与样本以及其它一抗的非特异性杂交。

      在二抗的种属来源角度,因为需要考虑一抗的不同种属来源,以及免疫荧光封闭血清的选择。二抗的种属与一抗的种属最好有所区别,同时考虑到血清的种属来源要与二抗一致,所以最优的情况是,IF多标实验中二抗的种属来源于非小鼠、非兔、非山羊,而是选择驴、马、鸡等种属来源,并且二抗采用一样的种属来源,这样可以一种来源的血清完成两个抗体的封闭。IFkine?系列荧光二抗均来源于驴,可以配合驴血清进行封闭,效果非常好,在免疫荧光双标以及多标实验中有更出众的表现。I

      作为独特的系列新型荧光抗体产品,IFKine具有市场上最高的荧光染色亮度和耐光性,并兼具较少的非特异性杂交和背景,非常适合作为免疫荧光和流式细胞术实验。驴来源二抗以确保在多标使用中的通用型,并且经过特殊处理,其与其它种属来源的蛋白样本或抗体几乎没有交叉反应,因此其在免疫荧光分析的双标以及多标实验中有更出众的表现。

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