在线客服
  • |
  • 400-821-8800
  • |
  • 手机西域
    手机西域下载二维码

    开发者:西域智慧供应链(上海)股份公司

    版本:4.7.6

    扫一扫,下载西域客户端
    手机采购 移动办公
    iPhone Android
  • |
  • 快速下单
  • |
  • 我的西域
  • RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:11685

      一、RNA 提取前的准备

      RNA 制备的关键是要抑制细胞中的RNA 分解和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。因此,在实验中必须采取以下措施:

      1、戴一次性手套

      2、使用RNA 操作专用实验台;

      3、在操作过程中避免讲话等。

      通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA 分解酶的污染。

      二、使用器具

      尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理: 1、用0.1%DEPC水溶液在37℃下处理12小时,2、然后在120℃下高温灭菌30min 以除去残留的DEPC ,

      ( RNA 实验用的器具建议专门使用,不要用于其他实验。)

      三、 试剂配制

      用于RNA 实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60min )或使用上述方法进行

      (也可以使用RNA 实验用的一次性塑料容器),DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装

      使用的无菌水需用0.1%的DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。

      RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用,避免混用后交叉污染。

      四、实验操作

      在研磨样品前,先把所要用到的试剂和枪头、研钵(未拆开报纸)放在超净工作台上,打开紫外灯照射20-30min 杀菌。

      1. 50-100mg的普通组织样品:RNAiso Plus 1ml

      2. 试验样品的研磨和匀浆

      (1)将超低温冻结的RNA 提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,

      用研钵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的课件颗粒,如果没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量)。(研磨好的样品立即加入 RNAiso Plus)

      (2)对于普通的RNA 提取样品,可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。

      (3)将匀浆液转移至离心管中,室温静置5min 。

      (4)12000g 4℃离心5min 。

      (5)小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。

      3.Total RNA 的提取

      (加入RNAiso Plus 后,静置5min ,离心转移上清,避免未破碎的杂蛋白污染)

      (1)向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus 的1/5体积量),盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15s (氯仿沸点低,易挥发,振荡时应小心离心管突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后,再室温静置5min 。

      (2)12000 g 4℃ 离心15min 。

      (3)从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。

      (4)向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15-30℃下静置10min 。

      (5)12000g 4 ℃ 离心10min 。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。

      4.RNA 沉淀的清洗

      小心弃去上清,缓慢的沿离心管壁加入75%的乙醇(用DEPC-Water 配制),轻轻上下颠倒洗涤离心管壁,12000g 4℃离心5min 后1ml (切勿触及沉淀)

      小心弃去乙醇(为了更好的控制RNA 中的盐离子含量,应尽量除净乙醇)。

      5.RNA 的溶解

      室温干燥沉淀2-5min (不可以离心或加热干燥,否则RNA 将会很难溶解,有关RNA 溶解可以参考Troubleshooting 中的相关说明),加入适量的Rnase-free 水溶解沉淀,必要时可以用移液抢轻轻吹打沉淀,待RNA 沉淀完全溶解后于-80℃保存。(提取的RNA 立即进行反转录,确保RNA 不降解,剩余的RNA 标记好放到旁边-80℃冰箱保存。)

      PCR 扩增

      1. 反转录反应

      (1)在Microtube 管中配制下列混合液

      Dntp Mixture(10Mm each)

      Oligo Dt Primer (2.5uM)

      Total RNA

      Rnase Free dH2O

      1ul 1ul 5ul Up to 10 ul

      (2) 在PCR 仪上进行变性、退火反应。

      65℃5min

      4℃

      (说明:变性、退火操作有利于模板RNA 的变性以及反转录引物和模板的特异性退火,可提高反转录反应效率)

      (3) 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube 管底中。

      (4) 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液

      上述变性、退火后的反应液

      5×PrimeScript TM Buffer

      Rnase Inhibitor (40U/ul)

      PrimeScript TM Rtase (for 2 Step)

      Rnase Free Dh2O

      Total Volume

      (反转录的体系做成40ul) 10ul 4ul 0.5ul 0.5ul 5ul 20ul

      (5) 在PCR 仪上按下列条件进行反转录反应 42-50℃15-30min

      95℃5min

      4℃

    免责声明:文章仅供学习和交流,如涉及作品版权问题需要我方删除,请联系我们,我们会在第一时间进行处理。
    相关资讯
    沪公网安备 31011502008645号 | 沪ICP备09003861号 | 增值电信业务经营许可证:合字B2-20200044 | 第二类医疗器械经营备案编号:沪浦药监械经营备20200151号 | 医疗器械经营许可证编号:沪浦药监械经营许20200092号 | 互联网药品信息服务资格证书编号:(沪)-经营性-2020-0028 | 危险化学品经营许可证:沪(浦)应急管危经许[2023]205876 | 食品经营许可证书编号:JY13101155461219 | 营业执照