一、概述
M-MLV反转录酶是从莫洛尼鼠的白血病病毒中获得的，M-MLV是将病毒中的反转录酶进行遗传性上的整改，除去它的核糖核酸酶H活性后形成的一种反转录酶，在使用M-MLV反转录酶进行RT时需要Mg或Mn离子作为辅助因子。
逆转录酶(M-MLV)从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的dna聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。
逆转录酶(M-MLV)一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。
二、组份
Cat KGEM01(4000units) KGEM02(10000units) KGEM03(20000units)
逆转录酶(M-MLV) 20μL 50μL 100μL
10×M-MLVReactionBuffer 50μL 150μL 300μL
DTT 30μL 80μL 150μL
三、合成第一链cDNA的步骤
以下试剂客户自己提供
dNTPs(10mM)
随机引物(oligodT(18)或随机引物或特异性引物;引物选择请参考下页“注意事项”)
无核酸酶双蒸水
RNA模板
RNase抑制剂
RT反应(20μL体系)：
1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s;
2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，依次加入
2～5μgRNAnμL
引物﹡1μL
【引物﹡：OligodT(18(10μM)或随机引物(50ng/μL)或特异性引物(2μM)】
dNTPs(10mM)1μL
补加无核酸酶的双蒸水至总体积15.5μL
3、65℃保温5min，然后冰浴5min;
4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份
RNase抑制剂(40u/μL)0.5μL
10×M-MLVReactionBuffer2μL
DTT(200mM)1μL
逆转录酶(M-MLV)1μL
5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s;
6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min;
7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。
四、注意事项
在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：
1、RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。
2、引物的选择
OligodT
选择OligodT时，要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，所以对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，一般不推荐。
M-MLV反转录酶与AMV反转录酶相比，M-MLV反转录酶缺乏连续性，因此若想使用M-MLV反转录酶获得较大量的cDNA就要使用比其他酶更多的量。M-MLV反转录酶的活性能够被亚精胺抑制，因此在使用时不能用含有亚精胺的缓冲液。
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