醋酸膜蛋白电泳仪：血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

　　【实验目的】

　　1. 掌握血清蛋白质电泳的基本原理和基本操作过程。

　　2. 熟悉血清蛋白质醋纤维素薄膜电泳图谱的含义及临床意义。

　　【 实验原理】

　　1. 电泳的基本原理

　　带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。

　　电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。带电颗粒 ( 球形分子 ) 在电场中的电泳速度 (V)

　　从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度 (V) 与颗粒带电荷量 (Q) 以及电场强度 (E) 成正比，与球形分子的大小 ( 半径为 r ) 及所在介质的粘度 (η) 成反比。因此 , 在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。

　　在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（ move rate,M ）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即

　　可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；反之越慢。但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。

　　2. 影响电泳的主要因素

　　(1) 电泳介质 pH 值的影响 : 对于蛋白质和氨基酸等两性分子，电泳介质的 pH 值影响蛋白质的电离情况，即可决定蛋白质的带电量 (Q) 。 pH 值小于等电点，分子带正电荷，向负极泳动，如果 pH 大于等电点，分子带负电荷，向正极泳动。 pH 值偏离等电点越远，分子所带净电荷越多，其泳动速度越快。当缓冲液 pH 等于其等电点时，分子处于等电状态，不移动。由于血清蛋白质的等电点多在 pH4 ～ 6 之间，因此，分离血清蛋白常用 pH 8.6 的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 缓冲液。

　　(2) 缓冲液的离子强度 : 离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持 pH 的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量 ( 压缩双电层 ) 使电泳速度减慢。所以常用离子强度为 0.02 ～ 0.2 之间。

　　(3) 电场强度的影响 : 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长 15cm ，两端电压 ( 电势差 ) 为 150V ，则电场强度为 150 ／ 15=10 V ／ cm ，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。 随着电场强度的增高，电流强度增加，产热也增多。产热的不良后果是： ① 引起水的蒸发，改变溶液 pH 及离子强度； ② 引起介质温度高，可使蛋白质变性。因此电泳必须控制电压在一定范围之内，当进行高压电泳时，必须装备有效的冷却装置。

　　(4) 电渗 : 在电场中，由于多孔支持物吸附水中的离子使支持物表面相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，此种现象称为电渗。如纸上电泳所用的滤纸纤维素带有负电荷；琼脂糖电泳中，所用的琼脂糖由于大量硫酸根的存在也带有负电荷，它们使水感应产生水合氢离子 (H+3O) 。在外电场的作用下，水向负极移动。如果被测定样品也带正电荷，则移动更快；如果被测定样品带负电荷，则移动减慢。所以电泳时，颗粒泳动所表现的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。因此在选用支持物时，应尽量避免高电渗作用的物质。

　　3. 醋 酸纤维素薄膜电泳

　　醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构（厚约 120 μ m ），渗透性强，对分子移动无阻力，用它做区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便 , 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。

　　本实验以醋酸纤维素薄膜作为支持物，于薄膜一端加微量血清，膜两端连接于缓冲液。血清蛋白质的等电点均低于 pH7.0 ，电泳时常采用 pH8.6 的缓冲液，因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极移动，因泳动速度不同而被分离。醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白质分离为清蛋白 A 、 α1 、 α2 、 β 和 γ - 球蛋白，将蛋白质染色后，可按染色区带位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定。

　　【 器材和试剂】

　　1. 器材 电泳仪、醋酸纤维素薄膜（ 2.5 cm ×8cm ）、染色液盘、漂洗盘、镊子

　　2. 试剂

　　(1) 巴比妥缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.075 ）：巴比妥钠 15.46g ，巴比妥 2.78g 加蒸馏水数百毫升 , 加热溶解后再补加蒸馏水至 1000ml, 混匀。

　　(2) 染色液：氨基黑 10B 0.5g ，溶于甲醇 50ml 中，再加冰醋酸 10ml ，蒸馏水 40ml 混匀。

　　(3) 漂洗液：甲醇（或 95% 乙醇） 45ml ，冰醋酸 5ml ，蒸馏水 50ml 混匀。

　　(4) 洗脱液： 0.4mol/L NaOH 溶液

　　(5) 透明液： 95% 乙醇 75ml ，冰醋酸 25ml 混匀。

　　【 操作步骤】

　　1. 点样 将醋酸纤维薄膜 (2.5cm×8cm) 一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端 2.0cm 处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸 ( 或纱布 ) 贴紧，加盖，平衡 2 ～ 3min ，然后通电。

　　2. 通电 一般电压用 110 ～ 140V ，电流约 0.4 ～ 0.6mA ／ cm ，时间 45 ～ 60min 。

　　3. 染色 关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染 2 ～ 3min ，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。

　　4. 定量 取试管 6 支，编号依次为 0 （空白）、 A 、 α1 、 α2 、 β 、 γ ，将电泳图谱亦按 A 、 α1 、 α2 、 β 、 γ 蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约 α1 带的空白带放入空白管中。各管中加 0.4mol/L NaOH 4ml ，振摇数次，使染料色泽浸出， 30min 后，在 620nm 波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及 α1 、 α2 、 β 及 γ 球蛋白各管的吸光度。

　　【 计算】

　　吸光度总和 T 为各种蛋白吸光度的总和： T =A + α1 + α2 + β + γ 。 分别 按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：

　　清蛋白 (%) ＝ (A/T)×100% α 1 球蛋白 (%) ＝ ( α 1 /T)×100%

　　α 2 球蛋白 (%) ＝ ( α 2 /T)×100% β 球蛋白 (%) ＝ ( β /T)×100%

　　γ 球蛋白 (%) ＝ (γ/T)×100%

　　现在许多实验室采用光密度计定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约 5 ～ 10min ，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。

　　【注意事项】

　　1. 电泳时，电压应控制在 110 ～ 140V ，不能过高，若电压太高，产热量大，则蛋白质标本会破坏，并且电压高则带电颗粒移动速度快，分离效果不理想。

　　2. 醋酸纤维素薄膜在电泳前，一定要在缓冲液中浸透，否则有碍电泳分离，最好是浸泡过夜，效果最佳。

　　3. 点样时样品一定要点在无 光泽面，否则很难吸入，点样量 不宜过多（血清样品最适宜 3μl ）。其原因是醋酸纤维素薄膜承受蛋白质有限。量过多则分子量相近的物质相互争夺迁移而重叠，影响结果观察。

　　4. 电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。如必需进行，要先关闭电源。

　　【 思考题 】

　　1 ．电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成份？请分析原因。

　　2 ．电泳时，点样端置于电场的正极还是负极，为什么？

　　3. 电泳已开始，发现有错（膜条放置错误，滤纸未浸入缓冲液或电泳槽与电泳仪连线有错）怎样纠正（操作）？

　　4. 肝硬化和肾衰病人的醋酸纤维素薄膜电泳图谱和区带定量测定结果有何异常，为什么？