导读:醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白,1.掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法,蛋白质是两性电解质,蛋白质为正离子,蛋白质为负离子,血清中含有书中蛋白质,故可利用电泳法将它们分离,血清中含有白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同(见表一),血清中5中蛋白质的等电点大部分低于pH7.0,表一人体血清中各种蛋白质的等电点及
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白
一.实验目的
1.掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 2.掌握电泳仪的使用方法。
二.实验原理
蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极定向移动,在pH大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中想阳极移动。血清中含有书中蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH值得溶液中,所带净电荷不同,因此在电场中的移动速度不同,故可利用电泳法将它们分离。
血清中含有白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同(见表一),在电场中迁移速度不同,由表一可知,血清中5中蛋白质的等电点大部分低于pH7.0,所以在缓冲液(pH8.6)中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。
表一 人体血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量 蛋白质名称 等电点(pI) 相对分子质量/Mr 4.88 69 000 白蛋白 5.06 200 000 α1—球蛋白 5.06 300 000 α2—球蛋白 5.12 β—球蛋白 90 000—150 000 γ—球蛋白 6.85—7.50 156 000—300 000 在一定范围内,蛋白质的含量与结合的染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下,分别用0.4mol/L的氢氧化钠溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使血清中蛋白含量下降,肾病时α1、α2、β—球蛋白升高,γ—球蛋白降低。肝硬化时α2、β—球蛋白降低,而α1、γ—球蛋白升高。所以,可以测定人体血清中蛋白含量的值来诊断一些疾病。
三.实验器材
试剂: 巴比妥—巴比妥钠缓冲液、95%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、染色液
用品:醋酸纤维薄膜(x2)、人血清、培养皿(x3)、载玻片、盖玻片、电吹
风、 吸管5ml(x1)、2ml(x2)、直流稳压电泳仪、电泳槽、镊子、滤纸、烧杯100ml(x2)、锥形瓶300ml(x2)
1 四.实验步骤
1.薄膜浸泡
选择可用的醋酸纤维薄膜(2cmx8cm)两条,浸于缓冲液中30min以上; 2.电泳仪准备
连接号电泳仪的线路,检查电路是否可用,检查完毕后往电泳槽中导入电解液,即巴比妥—巴比妥钠缓冲液; 3.点样 (1)将浸泡30min以上的醋酸纤维薄膜弄镊子轻轻取出,将薄膜一面平放
在干净滤纸上,几秒后,把薄膜翻过来,把另一面平放在滤纸上,吸去多余的缓冲液,吸完后把薄膜平放于干净的玻璃上,准备点样; (2)取几滴人血清样品于载玻片上, 根据薄膜大小裁剪盖玻片大小,然
后用盖玻片轻轻蘸取血清样品,然后轻轻与薄一端1.5cm处接触,待薄膜上有一条清晰的血清痕迹即可点样结束; 4.电泳
(1)用镊子夹住薄膜两端,并把薄膜拉直,轻轻放到电极桥上,点样端为
阴极,并用镊子压薄膜与电极桥接触的两端,使其接触紧密;
(2)平衡10min后打开电源,调至90V,预电泳10min,随后再把电压调
至110V,电泳50min—1h; 5.染色
电泳完毕后,将薄膜浸于染色液中9min—10min 6.漂洗
(1)配制漂洗液:45ml95%乙醇+5ml冰乙酸+50ml蒸馏水;
(2)把染色完后的薄膜弄镊子取出,用漂洗液漂洗至背景为灰蓝色(大概
3—4次),漂洗结束后把薄膜贴于干净的玻璃上,用吹风机吹干。 7.透明和取带
(1)配制透明液:以无水乙醇:冰乙酸=7:3的比例配20ml; (2)薄膜用吹风机吹干后,浸入透明液中,值背景为透明为止,大概10min
左右,取出薄膜并贴于干净玻璃上,用吹风机吹干后轻轻从薄膜上揭下蛋白质带。
五.实验结果记录与处理
2 六.实验分析
1.薄膜浸泡必须30min以上,否则会影响电泳效果,取出薄膜吸取过多的缓冲液时,要注意不能长久放置于滤纸上,这样会使渗透于薄膜内的缓冲液被吸出来,使电泳时蛋白质不能完全分开,影响最后结果,而本次实验中,蛋白质区带区分并不明显,可能与此有关。
2.连接电泳仪线路时要注意正负极,用前检查电泳仪是否可用,在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零,否则一打开电源,瞬间电压过高会烧坏仪器。
3.在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线,且电极槽液面要保持一致,同时要漫过电桥,否则无法形成回路,不能进行电泳。
4.点样时要注意只需轻轻的点一下即可,有一条清晰的血清痕迹即可,且要注意不要距端口太近,而如果重复点样,重复点样会导致电泳结果不清晰,条带混杂,本次实验部分条带出现这种情况,可能是这个原因。
5.在把薄膜放到电桥上时,要注意点样区不能接触到电桥上的滤纸,且点样区放在阴极端,还有,薄膜必须要拉直,中间部分不能与电解槽接触。
6.配制漂洗液、透明液利用冰乙酸时要注意不能接触到手、皮肤或衣物,因为冰乙酸有强烈的腐蚀性,同时也要注意不可闻其气味,因为冰乙酸气味及其浓烈,对鼻黏膜有损害;染色液用完要注意回收。
7.漂洗时要注意时间产度,背景色变为灰蓝色即可,过度漂洗会使蛋白质条带也被洗掉,影响最后实验的结果。
8.进行透明时也要注意时间长度,时间过长也会引起蛋白质条带被清洗,但是过短也会使条带无法被撕下。
9.撕条带必须在完全干燥后,判断是否干燥的方法为用手触摸一下薄膜,要是感觉不粘手,则说明可以揭下,否则不能揭;在干燥时要注意也不能过度,过度则不易揭下,此时可以用蒸馏水润湿一下再揭下。