转染试剂：电转染法和化学试剂转染法

　　下面介绍三种转染或侵染细胞的方法：

　　■电转染靶细胞(推荐)

　　转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

　　另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

　　■电转染实验案例

　　使用Celetrix电转仪将pEGFP-N1质粒转染到悬浮细胞K562中，步骤如下：

　　1）离心收集细胞1000-1200 rpm 3min；

　　2）轻柔重悬细胞于少量无血清RPMI培养液中，再次离心收集；

　　3）轻柔重悬细胞于无血清RPMI培养液中，配成密度大约3×1066 cells/ml细胞悬浮液；

　　4）每个样品配至少约210ul体积，比电击管容量200ul稍多留点余地，加1ug pEGFP-N1质粒；

　　5）电击管放入电转仪进行1000V电转；

　　6）取出电转完成的细胞，转移到完全培养液进行细胞培养；

　　7）流式细胞仪检测细胞转染效率为80%。

　　■实验结果

　　■化学转染法

　　化学转染方法有多种，其中脂质体转染法、阳离子聚合物转染法和纳米颗粒转染法比较常用，这三类产品在市面上有很多，这里不做介绍了。

　　■慢病毒侵染法

　　可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等,但携带基因不能太大（<8kb）,细胞需处在分裂期。

　　步骤如下：

　　1. 293T细胞的培养

　　1）第1～2天内复苏293T（较低代次）的细胞，从液氮罐中取出冻存的细胞并迅速放入37℃热水中，轻轻晃动使细胞快速解冻。然后用70%的酒精擦拭细胞冻存管，拿入超净台中操作。以后所有步骤都应注意无菌操作。

　　2）第4～5天进行细胞传代，传代至10cm 培养皿中。

　　3）第7～8天，按照相应的接种密度接种至欲使用包装生产病毒的孔板或培养皿中并转移到无菌的细胞培养皿中。

　　※注意：293T细胞的生长状态影响病毒的生产，应使用较低代次的细胞，并于复苏后传代培养至少两代以上的293T细胞来进行包装慢病毒，但不能使用超过20代的细胞。

　　2. 转染

　　共转染前进行质粒大提，稀释至质粒浓度为1μg/μl，转染前48小时，接种细胞至备用生产慢病毒的孔板或是培养皿中，转染时，细胞汇合度约为70%-80%为最佳感染状态，活力≥95%以上。电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：GP7901)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106（另外，您也可以使用转染试剂转染）。

　　a) 加入800ul 0.25%胰酶消化大概30s，随时观察细胞形态，消化结束，加入2倍胰酶体积的完全培养基终止消化，吹打均匀；

　　b) 25℃，900rpm，离心5min，去上清；

　　c) 加入1ml PBS，重悬后，25℃，900rpm，离心5min，去上清，重复此步骤1～2次；

　　d) 加入200 ul无血清的培养基，重悬细胞，各加入5μl pGLKO linear vector和Packaging Mix；

　　e) 离心过程中，可准备电转设备，开通电源，移液枪吸取200ul的细胞悬液至电极管中（保证不要出现起泡），按照1200V，20ms，2/pluses电转条件进行电转；

　　f) 电转结束，放入预先准备好的孔板或是培养皿中，加入适量的含血清浓度为2%～10%的DMEM培养基，细胞培养箱培养。

　　※注意：293T细胞的生长状态影响病毒的生产，应使用较低代次的细胞，并于复苏后传代培养至少两代以上的293T细胞来进行包装慢病毒，但不能使用超过20代的细胞。

　　3. 慢病毒收获与储存

　　以电转时间为起始点，一次收获时间为24hr后收获上清，保存于4℃下，并补足适量培养基。二次收获时间为36~48hr间，收获上清，可以与一次收获病毒合在一起，并补足适量培养基。三次收获（此次可需要也可不需要，时间超过72hr，细胞活力严重下降，生产病毒能力减弱，病毒量较低）时间为72hr，收获上清，与前两次收获可合在一起。

　　※注意：若短时间内不使用慢病毒进行实验，请放置于-80℃保存（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。

　　4. 慢病毒侵染靶细胞

　　接种适量靶细胞，可加入4-8ug/ml的polybrene以提高感染效率，混匀。于25℃，800g下，贴壁细胞离心30min~1h，悬浮细胞离心1.5~2.5h，离心结束后，放于37℃，5%CO2培养箱，24小时后，更换新鲜的完全培养基。