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　　一，动物的免疫

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip

　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　二，融合与筛选

　　最重要的一步是融合，我想这也是单抗制备过程中最难的一步了。

　　(一)　细胞融合流程

　　1　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　2　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　3　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

　　4　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

　　5　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　6　在室温下融合:

　　①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③　加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　7　离心，800rpm，6分钟。

　　8　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

　　9　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　10 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。

　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞。

　　三、抗体的鉴定

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

　　3.　FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、性质检测

　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

　　1.　抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②　制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。