WB检测之内参抗体，您选对了吗？

　　内参抗体选择

　　常用的蛋白内参有GAPDH和β-actin或β-tubulin，内参的选择原则是选择与靶蛋白分子量相差5KD以上的内参，对不同的样本则需要根据实际情况进行选择。

　　1.根据物种选择

　　哺乳动物来源的组织或细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+/K+-ATPase等。植物来源的样本常选择plant actin、Rubisco等。对于其他研究稀少的物种可参考报导的文献进行选择。以GAPDH为例，抗GAPDH单抗（ABGENT，clone 6C5）能够与非洲蟾蜍、猴、猪、羊、狗、猫、鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。

　　2.根据组织类型选择

　　以肌动蛋白actin为例，肌动蛋白actin在不同物种之间高度保守，且同一物种不同类型actin的序列相似性大于90%，使其很难获得特异性较好的抗actin抗血清。但同一物种不同类型actin的N段序列相似性仅50~60%，故N端序列常被用来制备抗actin的抗体。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌、横纹肌细胞和平滑肌细胞中，γ型分布于平滑肌细胞和非肌细胞中，β型分布于非肌细胞中，共六种actin蛋白。不同厂商生产抗β-actin抗体过程中选择的免疫区段在不同型actin之间的保守与否影响到抗体的组织特异性。选用β-actin N端的16个氨基酸序列制备的单多抗占大多数，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用β-actin C端16个氨基酸序列制备的抗体则可以在肌肉细胞中检测到actin的信号。

　　3.根据蛋白组分选择

　　提取细胞蛋白组分过程中，胞浆蛋白通常是最先提取出来的。离心全细胞裂解液所得的上清含胞浆蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，继续加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通过特殊的方法还可以从胞浆蛋白中提取到线粒体蛋白、叶绿体蛋白等。针对不同的细胞组分需要选择不同的内参抗体。