亲和色谱法及其在我国的研究发展状况

　　亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。技术蓬勃发展，中国色谱专家同时也非常注重国际间色谱技术的交流。随着国际间交流加深，中国的色谱技术已经跟上了世界的步伐。色谱与生命科学的交叉研究、色谱与其它分析技术的联用表现得异常活跃。

　　1．亲和色谱

　　1.1色谱概述

　　20世纪初，俄植物学家茨维特首次提出色谱法。他把碳酸钙粉末装到玻璃管中，将植物叶子的石油醚萃取液作为样品倒入管内，然后再用石油醚自上而下洗脱。随着洗脱的进行，植物叶子中的各种色素向下移动逐渐形成一圈圈的色带，茨维特将这种色带分离过程称为色谱，所用的玻璃管内的碳酸钙填充物称为固定相,洗脱用的石油醚称为洗脱液或洗脱剂，也就是我们常说的流动相。后来，采用该法分离了许许多多的物质，虽然分离过程中看不到色带存在，但色谱法一直沿用至今。

　　色谱法在当今物质尤其是具有生物活性物质的分离中起到举足轻重的作用。然而在色谱发展的早期有许多的人往往将色谱看做一种艺术, 但是随着色谱理论的发展，以及色谱技术的不断推广，色谱逐渐的称为了一种科学。对于从事生物大分子分离的物质常常用一句话来形容色谱的重要作用：“色谱技术是当今生物工程下游技术的核心”。当今的色谱法包括分离和检查两部分，能够同时实现分离和分析。色谱法也必定会随着材料、生物等多学科研究的深入会更加广泛的应用到分离科学和分析化学之中的。

　　将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法。

　　在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。 亲和色谱法的基本过程是：

　　1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。

　　2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来

　　亲和色谱是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混合物中某一分子的含量。 亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。 1.2一般流程

　　亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。 1.3特殊应用

　　亲和色谱的用途很广泛，可以用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白，还可以从血浆中分离抗体。分离重组蛋白就经常使用亲和色谱。通过基因修饰为蛋白加上一些人为的特性，这些特性使蛋白选择性地与配体结合，从而达到分离的目的。亲和色谱的另一大用途是从血浆中分离抗体。 1.4影响亲和色谱的因素

　　1.4.1上样体积

　　若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较

　　弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。

　　1.4.2、柱长

　　亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果亲和介质的载量高，与目标产物的作用力强，

　　可以选择较短的珠子；相反，则应该增加柱子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。

　　1.4.3、流速

　　亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的

　　流速应尽量的慢，保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间结合力弱和样品浓度过高时。

　　1.4.4、温度

　　温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲和力，充分地结合；而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行洗脱。

　　2．研究现状

　　膜亲和色谱是人们将亲和色谱和膜技术结合起来研制的，以膜为基质的亲和色谱，其基本原理是将微滤膜或超滤膜经表面改性活化处理后，偶联上合适的配基，使固定在膜载体上的配基特异性地与待分离的生物大分子结合成复合物，再经洗脱是生物大分子得以分离纯化。因此亲和膜色谱技术即具有膜技术分离快，处理量大的特点，又具有亲和色谱特异性高的优点。目前亲和膜色谱法已成为分离纯化生物大分子的重要手段之一。链接到膜基质上的配体分为两大类：生物特异性配体和基团特异性配体，后者又称为通用性配体。以此为依据，可以对膜亲和色谱法进行分类，常见的有生物亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯合亲和色谱等。

　　生物亲和色谱中连接到基质上的配体是存在特异性相互作用的生物大分子，如酶与底物，酶与抑制剂，激素与受体等，因而具有高度的选择性。但是这类生物大分子通常价格昂贵且不易连接到基质上，限制了它们在大规模工业生产中的应用。

　　免疫亲和色谱是将抗原抗体中的一方连接到基质上来吸附纯化另一方的色谱分离技术。随着可利用的单克隆抗体技术的发展，免疫亲和色谱的应用日益广泛，期工业化应用前景广阔。

　　金属螯合亲和色谱又称固定化金属螯合亲和色谱，是Porath等首先提出来的。在上世纪70年代他们将铜离子、锌离子通过螯合剂亚氨基二乙酸交联到Agatose上，利用金属离子与蛋白质表面组氨酸等的配位作用选择性的分离对金属离子有亲和里的蛋白质。期理论基础是不同条件下配位键的形成和解离，即过渡金属离子(铜，铁，锌，镍等)与蛋白质表面的组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等电子供体形成配位复合物，因而连接上这些金属离子的载体就能选择性的吸附含有咪唑基或巯基的肽类或蛋白质。吸附力的大小在很大程度上取决于蛋白分子表面咪唑基或巯基的稠密程度。此外，不同的金属离子对亲和力大小也有影响。80年代，人们又提出用微孔的膜作支撑基质，充分发挥了膜过程设备简单，易放大，成本低，分离速度快，可连续操作等优点，是生物工程产品的工业化大规模分离纯化得以实现。一、中国色谱技术的发展历程有机高分子方面应用

　　亲和色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离纯化是有特殊意义的。如果说前面所介绍的几种色谱方法都是通用性分离技术的话，那么;23 方法则基本上是属于专一性的，前者是根据溶质分子之间在物理化学性质方面的差异所建立的分离方法，后者则利用了生物分子之间特异性相互作用而实现分离的。这种特异性相互作用是活性生物大分子固有的特征，例如酶能与底物、抑制物、辅酶等结合，抗体能与互补的抗原相结合，凝集素能与细胞的表面抗原以及某些糖类相结合，激素能与蛋白及细胞受体形成复合物，基因可与核酸和阻遏蛋白相互作用等等。所以，原则上讲，如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲和色谱方法，用于分离与配基相对应的物质。

　　亲和色谱的显著特点是，具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，而且能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高，所以这种技术用于纯化酶、抗体、核酸、辅助因子和各种能识别、贮存和运载具有生化和药理作用物质的蛋白质，用于生物样品解离常数和平衡常数以及动力学序列和结合机制的研究等，都是很有意义的。

　　有机高分子类型的AFC填料，按其基质材料，可分为多糖型和高聚物型两大类；按其配体性能即填料所携带配体对被分密物质的选择性特征，可分为专用性和通用性两大类。专用性填料，例如基于抗原与抗体、激素与受体蛋白等特异性相互作用的填料，其配体对于目标化合物有很高的特异选择性和亲和能力。通用性填料因其配体可与数种生物分子产生亲和作用，显然达不到专一的选择性，但这类配体的种类很多，价格低廉而容易获得，应用范围非常广泛，所以在亲和色谱中仍处于主导地位。常见的通用性亲和配体，主要包括金属螫合配体（如螫合

　　了Cu2+、Ni2+、Zn2+ 等金属离子的配体），小分子类配体（如氨基酸、肽类、明胶、肝素等），颜料类亲和配体，外源凝集素类亲和配体（如刀豆球蛋白A、扁豆外源凝集素、麦芽外源凝集素等）、核酸与核苷酸类亲和配体。

　　从亲和配体的连接方式来看，既可以将配体与基质直接偶联，也可以在基质与配体之间插入一如适当长度的链状间隔臂。大量研究表明带有间隔臂的AFC填料往往具有更为优异的色谱性能，由于适当的间隔壁链段可以有效地克服基质表面的几何位阻效应，使得配体更容易与被分离物质相结合。对于以小分子为配体来分离大分子的亲和填料来说，间隔臂的作用就更为重要了。AFC填料的间隔臂按其结构类型，主要包括脂肪链的烃类、链状的聚胺类、肽类、链状聚醚类等。间隔臂有亲水性的，也有疏水性的，间隔臂链段长度则视其结构与性能不同而

　　异，例如疏水性的脂肪烃类链段，一般为2-10个亚甲基的长度，过长会因其自身返折而失去作用，也会因其产生强疏水性吸附而对蛋白质的分离不利。

　　3．在我国发展状况

　　3.1发展历史

　　新中国成立之后，色谱技术最初只应用于石油领域，到了20世纪60年代，才开始应用于国防领域。新中国的色谱技术在老一辈色谱科学家的带领下，取得了长足的进步：

　　1954年，卢佩章院士首先把气-固色谱法的体积色谱成功的应用于水煤气合成产品的气体组分分析；

　　1956年成功开展气液的体积色谱成功用于石油产品分析；

　　1961年朱葆琳领导丁景群开展了毛细管色谱的研究，并成功地用于石油产品的分析； 1964年第一颗原zi弹爆炸前，最后获得的铀235金属中的痕量气体分析，我国的色谱工作者在1963年1月份就开始本项金属中痕量氩的测定，并与年底完成；

　　1956-1958年发表了用液相色谱分析石油，油页岩和煤焦油组成的结果，建立了用碘和碘仿作为柱內显谱剂的快速测定烷、烯、芳三元组成分析方法样品用量0.5ml，分析误差在1%以内，平均分析时间为1h，并将分配色谱和紫外光谱联合的方法用于分析低沸点酚类的单体组成；

　　20世纪60年代后期，现代高效液相色谱技术获得飞速发展，引起了国内色谱界的重视，1974年，卢佩章等开始从事高效液相色谱研究，针对了当时高效液相色谱的两个主要矛盾：一是仪器设备，二是固定相，开展了微粒型硅胶及其各种化学键合相得研究，并提供了产品供应的国内需求；

　　1968-1974年完成核潜艇用船用色谱仪；连续测定密闭舱中的大量和微量有毒气体的组成，确保了潜艇人员在水下长期作业的生命安全和生活需要，这也是当时世界zui先进的船用色谱仪；

　　文化大革命后，随着改革开放的到来，中国色谱技术有了高速的发展，应用领域也在扩大，主要的应用领域如下：

　　·石油和石油化工分析：油气田勘探中的化学分析、原油分析、炼厂气分析、模拟蒸馏、油料分析、单质烃分析、含硫/含氮/含氧化合物分析、汽油添加剂分析、脂肪烃分析、芳烃分析；

　　·环境分析：大气污染物分析、水分析、土壤分析、固体废弃物分析；

　　·食品分析：农药残留分析、香精香料分析、添加剂分析、脂肪酸甲酯分析、食品包装材料分析； ·药物和临床分析：雌三醇分析、儿茶酚胺代谢产物分析、尿中孕二醇和孕三醇分析、血浆中睾丸激素分析、血液中乙醇/麻醉剂及氨基酸衍生物分析；

　　·农药残留物分析：有机氯农药残留分析、有机磷农药残留分析、杀虫剂残留分析、除草剂残留分析等；

　　·精细化工分析：添加剂分析、催化剂分析、原材料分析、产品质量控制；

　　·聚合物分析：单体分析、添加剂分析、共聚物组成分析、聚合物结构表征/聚合物中的杂质分析、热稳定性研究；

　　·合成工业：方法研究、质量监控、过程分析；

　　1980年，张宗炳指导研究生，用纸层析及高效液相色谱(HPLC)方法首次鉴定出这种芳香胺类为酪胺；

　　20世纪80年代到21世纪初，是色谱技术发展最快的20年，许多崭新的色谱法方法开始出现，如在气相色谱中的毛细管柱工艺的发展，毛细管超临界流体色谱和超临界流体萃取的兴起，毛细管电泳的发展，电名谱加入色谱的行列，场流分离为生物大分子的分离提供了新的途径等等。21世纪将是生命科学，材料科学，信息科学，和环境科学的时代，而环境科学又是人们面临的重大课题，色谱法新方法的出现和发展正是服务于这些重要科室领域的新技术。为了生物大分子的分离和纯化，推动了毛细管电泳和全新的高效液相色谱的发展；为了解决药物对映异构体的拆分，发展了各种各样的手性分离介质；为了极数微量环境污染物的检测，发展了各种色谱高灵敏检测器；为了适应石油化工的需要，出现了各种高温毛细管气相色谱法方法；为了能高选择性地分离生化分子，发展发选择性极强的亲和色谱柱和方法为了有效快速地分离蛋白质和多肽发展了整体色谱柱。另一方面，为了弥补色谱法定性功能较差的弱点，大力发展了色谱和其他仪器的联用技术，特别是液相色谱、气相色谱和毛细管电泳与质谱的联用技术近年已趋于成熟，对生物大分子的分离和鉴定发挥极大的作用，因此色谱仪和其他各种仪器的联合使用将成为分析化学的重要领域。

　　3.2新中国色谱仪器行业的兴起

　　1953年在新中国第一个五年计划中，由卢佩章院士领导的研发小组首次设计出我国第一台体积色谱仪，使分析石油样品的速度由原来的30多个小时缩短到不到1小时，而且所用样品量仅是原来的千分之一；

　　1962年，徐民宗等先后研制了101A型及P-150型气相色谱仪。P-150型气相色谱仪由大化所仪器厂小批量生产供院内研究所使用；

　　1963年，朱葆琳、丁景群 等研制成SP-01型氢火焰离子化鉴定毛细管色谱仪并推广到北京科学仪器厂生产；

　　1964年，汪骥、钟衡等成功研制的SP-02型氢火焰离子化鉴定器填充柱气相色谱仪。在国内建立了第一个色谱仪器生产厂---大连市第二仪表厂；

　　1965年，研制了SP-04型高纯永久性气体自动分析色谱仪，用于分析纯氮中的杂质氧、氩，或者纯氩中的杂质氧、氮，由南京分析仪器厂生产；

　　1965年，丁景群、陈大卫等研制成用于制备高纯化合物的PSZ-1型自动化制备色谱仪。并在此基础上，在朱葆琳的指导下有进一步放大研制成大型工业自动化制备色谱装置，1969年应用于天津试剂二厂试剂生产；

　　1973年，完成两种不同要求的密闭船内大气自动分析色谱仪，分别提供七机部五院及邯郸109*，供飞船及潜艇使用；

　　1973年，由杨书明、周良模等成功研制出实验室通用的SP-08型多用气相色谱仪；

　　1981年，唐学渊、钟秀贞等在国内首次成功用微机进行自动控制与数据处理氦气纯度分析仪。 中国的色谱事业在最近三十年里得到了飞跃性的发展，国内的色谱仪器厂家风生水起，面对国外品牌的竞争，依然在国内分析市场上占有一席之地，并保持了良好的发展势头，我们深信中国色谱仪器行业终将走出国门，走向世界。

　　三、新中国色谱技术走向世界国内色谱

　　技术蓬勃发展，中国色谱专家同时也非常注重国际间色谱技术的交流。随着国际间交流加深，中国的色谱技术已经跟上了世界的步伐：

　　1959年，卢佩章院士应邀参加前苏联第一次全苏色谱会上作大会报告，并在前苏联色谱创始人的著作和前民主德国的著作中被引用；

　　1960年，民主德国色谱学会主席struppe博士发表在其所著的《气相色谱的新进展》一书中共收录了三篇过过学术文章，其中包括卢佩章院士在全苏色谱会议上的大会报告；改革开放后，中国的色谱技术迅速发展，中国的色谱技术再次走出国门走向世界，中国与德国开展可深入的交流。1981年11月份中德第一届色谱会议在大连召开标志着中国正式与德国建立又好的学术交流关系，迄今为止中的色谱会议已经成功举办七届；

　　1980年PE公司到大连化物所研究考察； 1982中国首次参加匹兹堡会议； 1981年中德色谱会议在大连召开，

　　1985年首届BECIA大会在北京召开，国际上大多数的知名色谱学者参加了本次会议，促进了中国色谱技术与国外色谱技术的交流，标志着中过色谱事业已经成功与世界色谱事业接轨，中国有了自己的分析科学与仪器方面的国际会议；

　　近年来，中国的色谱研究有了较大的发展，取得了一些在国际上有影响的成果，在国际一流学术期刊上发表了相当数量的论文，为国家的经济发展作出了贡献，这是应当充分肯定的。特别是色谱与生命科学的交叉研究、色谱与其它分析技术的联用表现得异常活跃。

　　近年来，利用固定化金属螯合亲和膜分离纯化蛋白质的研究取得了很大进展。美国公司曾报道用以木纤维为原料的复合纤维素离子交换机金属螯合膜色谱分离纯化人尿激酶;鲍时翔等人采用中空纤维膜成功的 从人血清中分离出免疫球蛋白。另据报道，Iwata等在聚丙烯膜上接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯，制得铜离子亲和膜用于吸附含有组氨酸-亮氨酸的多肽以及牛血清蛋白。Klaus等则以化学改性的聚砜作为膜材料，制得金属离子螯合亲和膜，用于组氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和丙氨酸等小分子氨基酸混合物的分离等开展了用聚乙酰氨基葡萄糖亲和膜分离溶菌酶的研究。

　　随着研究的深入，科学家又提出通过遗传学的重组技术，在待分离的蛋白质表面连接上对金属离子有亲和性的氨基酸残基(如组氨酸，半胱氨酸，色氨酸等)，以促进蛋白质的分离和纯化，使固定化金属螯合亲和膜分离纯化蛋白质的应用前景更加广阔。