实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，FQ RT-PCR)是检测低丰度mRNA的敏感方法，为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。
RT-PCR内参基因的选择作一简要综述。1 内参基因应具备的条件 理想的内参基因应该满足以下条件：①
不存在假基因(pseudogene)，以避免基因组DNA的扩增；② 高度或中度表达，排除太高或低表达；③
稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；⑤其稳定的表达水平与目标基因相似；⑥
不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。
排除内参基因的条件则为：① 在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异；②呈现细胞周期依赖的表达；③
定位于x染色体。
内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成性表达，有助于保持细胞的功能。看家基因在某些类型细胞中的表达是恒定的，但在其他类型的细胞中则是变化的，尤其是与恶性疾病相关的临床标本。
常用内参基因的缺陷
90%以上的RT-PCR应用单一的内参基因来校正与标准化目标基因的表达，其中最常用的包括GAPDH、β-actin、18S
rRNA和28S
rRNA等。近年来的研究发现，这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织、细胞增殖和器官发育的不同阶段、体外培养、各种实验条件等情况下，它们的表达量通常变异较大。
2.1 GAPDH
GAPDH mRNA在不同癌组织(包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等)中的表达升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变化。在各种因素(例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等)刺激下，培养细胞GAPDH mRNA的表达水平也不同。
2.2 β-actin
当细胞向恶性转化时，β-actin mRNA的表达水平增加；而假基因的的存在也可干扰β-actin的检测。
2.3 18S rRNA和28S rRNA
有些学者认为28S rRNA和18S rRNA不是适合的内参基因。由于rRNA是由一种不同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成，前者是由RNA聚合酶I，后者是由RNA聚合酶Ⅱ。因此rRNA合成的调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种rRNA水平很少发生变化。然而，rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18SrRNA明显减少或停止表达。另外，rRNA用作内参还有如下缺点：①当对已纯化mRNA中的目标基因进行定量时，rRNA不能用于标准化；②rRNA高丰度表达，远远高于目标mRNA，较其他内参基因稳定且受RNA降解的影响较小；③rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录。
2.4 内参基因表达的影响因素
没有一种mRNA的表达水平在所有条件下是恒定的。在各种因素下，例如实验条件下细胞周期的不同阶段，看家基因mRNA的表达水平是变化的。
Radonic等证实传统的内参基因(包括β-actin 、GAPDH和PLA)明显地受有丝分裂原刺激的调节，反映出在许多实验条件下细胞的激活。Schmittgen等应用FQ RT-PCR研究血清培养下的NIH3T3成纤维细胞中4种看家基因β-actin、β2-MG、GAPDH和18S rRNA的表达，结果发现：血清饥饿24h后，接着用15%血清培养8h，虽然未改变这些细胞中总RNA的量，但是随着血清刺激时间的延长，mRNA的量显著增加。他们将每个时间点的mRNA和总RNA分别在两种条件下逆转录，一种是用等量的RNA进行反应，另一种则不对RNA的量进行标准化，结果发现：在两种逆转录条件下，β-actin和GAPDH的量分别增加9倍、2倍；对于18SrRNA，当总RNA量未标准化就进行cDNA合成时，其表达量随着血清刺激而增加，而当RNA的量标准化后，其表达量则不变；对于β2-MG，当mRNA量未标准化就合成cDNA时，其表达量增加2倍，且直接与mRNA的量成比例，而当mRNA量标准化后，其表达量则不受影响。这些提示在血清刺激条件下的基因表达定量研究中，β2-MG和18S rRNA作为内参基因是合适的，而β-actin和GAPDH则不适合。Hamalainen等应用FQ RT-PCR研究辅助性T细胞分化中的基因表达也发现：在体外细胞培养条件下，GAPDH mRNA的表达量变化显著。
即使从同一病理来源的细胞系，其内参基因的表达量也可能是高异质性的。Goidin等研究从同一黑素瘤患者来源的非侵入性1C8细胞和侵人性T1c3细胞发现：GAPDH和B-actin的表达量在T1c3细胞中均上调，应用18S rRNA作为内参，T1C3细胞中GAPDH和β-actin的mRNA表达量比1C8细胞高2倍多。
3 选择合适的内参基因
迄今适用于所有类型的细胞/组织所通用的内参基因可能不存在。正确选择内参基因，很大程度上依赖于所研究的细胞或组织，研究者应寻找适合各自实验系统的特异性稳定表达的内参基因。因此，适当内参基因的选择，需要在每种类型的细胞、每种类型的肿瘤和每种实验条件下进行。
Kim等对67例肝组织研究，发现UBC和HMBS对于实时定量RT-PCR分析是最准确的标准化因子，提示这2种看家基因对于肝组织的表达分析是最佳选择。Lupberger等应用FQ RT-PCR研究不同标本中3种常用内参基因β-actin、β-MG和PBGD的表达变化，在白血病细胞系K562中，三者的表达量依次为1544±246、65±30和22±8拷贝/每个细胞；在正常人的白细胞中，三者的表达量依次为491±97、40±17和<1拷贝/每个细胞；在各种恶性肿瘤患者的白细胞中，三者的表达量依次为84±51、106±8和<1拷贝/每个细胞。由于β-MG mRNA在不同来源的标本和不同类型的细胞中变异较小，因此他们认为β2-MG是最适合的内参基因。Radonic等在16种不同的组织和经过乙酸豆寇佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)和离子霉素(ionomycin)刺激的CCRFHSB-2细胞中，用FQ RT-PCR研究13种候选的内参基因(GAPDH、G6PDH、HPRT、PBGD、Alb、β-actin、Tub、TBP、β2-MG、PPIA、PLA、RPII和L13)的mRNA转录，发现传统的内参基因实际上是不适合的，而RPII在不同的组织和刺激的CCRF-HSB-2细胞中呈现最稳定的表达。RPII编码mRNA转录中的主要酶，所以RPII mRNA是自我调节循环中的一部分，它的蛋白则涉及一些细胞内mRNA的合成。因此，他们认为：RP lI是应用FQ RT-PCR进行RNA转录分析中内参基因的最佳选择；RP II对于多种组织是一种有用的候选内参基因，受TPA和离子霉素刺激的影响程度最低，提示对细胞激活有抵抗。
Lossos等应用以TaqMan探针为基础的FQ RT-PCR在12种不同的B细胞和T细胞来源的淋巴瘤或白血病细胞系、80种B细胞和T细胞的淋巴瘤标本以及静止和激活的正常B细胞和T细胞中检测11种内参基因(GAPDH、β-actin、PPIA、β2-MG、PRKG1、HPRT1、TBP、TFRC、RPLPO、GUSB和18S rRNA)，发现PRKG1和TBP以中等丰度表达，在细胞标本间变异性较低。因此，PRKG1和TBP是适合于在B和T细胞及其肿瘤中控制RNA的质量和产量。
目前，FQ RT-PCR广泛用于检测融合基因转录本以发现白血病中微小残留病变(MRD)的存在。为了选择适合于白血病中融合基因和异常表达基因定量检测的内参基因，欧洲抗癌计划中的一个研究小组应用标准的FQ RT-PCR方法筛选了14种内参基因(18S rRNA 、ABL、β2-MG、RPLPO、β-actin、GUSB、CYC、GAPDH、HPRT、PGK、PBGD和TFRC等)，考虑各种基因的表达水平及其稳定性，并排除假基因的存在，发现只有ABL、β2-MG和GUSB三者符合；进一步研究发现只有ABL mRNA在正常和白血病标本中的表达无显著性差别。因此，ABL可以用作检测白血病标本中融合基因转录本的内参基因，也可以应用于白血病中异常表达基因的定量。
在临床实践中，不同标本从活检到RNA提取之间的时间可能不同，这段时间的延长可能导致RNA降解，进而不同程度地影响所检测的内参和目标基因的表达水平。Lossos等认为，测定RNA总量，有助于使每个FQ RT-PCR反应中的RNA量均相同。Bustin等认为，体外实验中标本的标准化需要一组(可能2个或3个)在实验条件下其表达不受影响的看家基因。然而，针对细胞计数、总RNA或rRNA的标准化可能是更好的。当检测的是体内活检标本时，不可能预测何种内参基因最好，实际上所有内参基因的mRNA水平可能在一定程度上发生改变，导致标准化变得不准确，因此需要针对细胞数目、rRNA或总RNA浓度进行标准化。
4 应用
2个或多个内参基因进行定量优于单个所有的内参基因在确定的条件下有鉴别不同调节的潜能。在一组给定的标本或实验条件中，平行测定2个或以上看家基因的量有助于发现任何系统偏差。因此，许多学者建议：在应用FQ RT-PCR进行基因转录分析中，选择一个以上的内参基因用作内参可得到更可靠的结果 。 Schmid等应用FQ RT-PCR研究肾活检组织中三种常用的看家基因GAPDH、18S rRNA和CYC的表达，在小管间质性区域，18S rRNA和CYC的表达存在明显的正相关(r=0.96)，因此可用于该区域的基因表达分析，适合于大多数肾活检；然而，相对于18S rRNA和CYC，一些标本呈现较低的GAPDH表达水平，相关系数分别为0.77和0.73；在肾小球标本中，GAPDH 和18S rRNA的相关系数则更低(r=0.75)。因此，对于肾活检研究，应用一个单独的看家基因作为内参，基因表达比率的差别可能反映的是内参而不是目标mRNA的调节。将基因表达相对于几种平行的看家基因(例如18SrRNA和CYC)进行定量可得到准确的表达数据。
Vandesompele等在各种不同的人类组织中评估10种不同丰度和功能的看家基因，发现在一组标本中传统的单独应用一种内参基因作标准化将导致相对大的误差；而选择多种看家基因的几何均数作为标准化因子可用以标准化目标基因的表达。
总之，在FQ RT-PCR中，目前还没有一种内参基因用于不同标本间标准化的方法是完全令人满意的。因此，研究者应根据细胞和组织的类型以及实验要求的不同，选择最合适的内参基因，而且平行测定2个或2个以上看家基因的量将有助于得到更可靠的结果。
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