RT-PCR
逆转录PCR或者称反转录PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作"逆转录",由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互补DNA。
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单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA(每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
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CR 为反转录PCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real time PCR)共同的缩写。逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
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Q1:要做Real-Time PCR,而该种的β-actin未确定,我知道一般用持家基因作内参,但似乎其他基因各有缺点,有的作者用他们做内参时被SCI杂志要求用两个内参以证实,我想知道的是除了β-actin,哪个基因是SCI公认的内参基因(不用作两个内参了)?
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根据标本数量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,用1.5mL离心管分装,每管500μL(在体系配制区操作)。
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RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。
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Abstract:迄今为止,已确定9禽流感病毒神经氨酸酶(NA)的亚型。为了能更迅速的区分禽流感病毒的NA,对其进行了RT-PCR。在分析了GenBank509个完整的NA序列的基础上,设计了九对NA RT-PCR的特异引物。设计的引物能扩增部分NA的基因,并且对于每一个NA的亚型(N1—N9)是独一无二的。
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PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
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cDNA产量的很低
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转移1 pg~100 ng的poly(A)+RNA或者10 pg~1
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虽然两者都是通过抗原抗体反应对蛋白质进行检测,WB主要还是定性,Elisa可以定性,也可以定量。
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在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA。使用良好的无污染技术分离 RNA。在将组织从动物体取出后立刻处理。在 100% 甲酰胺中储存 RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂,不要加热超过 45℃ 或 pH 超过 8.0,否则抑制剂或释放所有结合的 RNase。而且,在≥0.8 mM DTT 时加入 RNase 抑制剂,一定要存在 DTT。
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在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。