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  • RT-PCR方法对禽流感NA基因的分型

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:1276

      Abstract:迄今为止,已确定9禽流感病毒神经氨酸酶(NA)的亚型。为了能更迅速的区分禽流感病毒的NA,对其进行了RT-PCR。在分析了GenBank509个完整的NA序列的基础上,设计了九对NA RT-PCR的特异引物。设计的引物能扩增部分NA的基因,并且对于每一个NA的亚型(N1—N9)是独一无二的。同时在一套分开的管子中进行九个RT-PCR,通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色后,NA的亚型被确定,与传统的序列分析法和禽流感病毒分离法比较,在确定禽流感病毒NA亚型方面,RT-PCR的方法有高达97.3%的敏感性和91.1%的特异性。结果表明,RT-PCR方法比传统方法更具敏感新和特异性。

      1、前言:

      禽流感病毒(AIVs)某些毒株是危害动物和人类公共卫生的人畜共患病。一般来说,AIVs对其自然宿主野生水禽是不致病的(Sturm-Ramirez et al.,2004),但有时它们在传播到其他物种时可能造成高的发病率和死亡率,其中包括家禽和哺乳动物(Vines et al.,1998;Fouchier et al.,2005)。AIVs也时常传播给人类,尤其是H5、H7、H9三个亚型。这也使得人们提高了对可能发生的新流感病毒的大流行的关注,并要求全面控制禽流感的迫切性。

      A型流感病毒是在他的两个表面糖蛋白(HA、NA)的基础上区分亚型的。迄今为止,已经分离了A型流感病毒的16个HA型和9个NA型(Fouchier et al.,2005)。A型流感病毒的复杂的生态学特性和高的变异性使得对其的控制构成严峻挑战。对于A型流感病毒的流行传播,广泛系统地对国内水禽和野生水禽的监控有着重要的意义。病毒敏感性和特异性的检测和毒株的分型是调查其流行病学的先决条件,也是防控流感爆发的重要战略。

      诊断AIVs的方法多种多样。AIVs的HA和NA的亚型通常由HI和NI实验辨别(世界动物卫生组织陆地动物诊断试验和疫苗手册,2008),这些方法都是在抗原抗体、免疫交叉反应的基础上建立的,具有很多局限性,如主观臆断、特异性低、敏感性低和精确性低等(Herrmann et al,2001; Fouchier et al,2005;Hoffmann et al,2001)。HA和NA的基因测序和序列分析为AIVs亚型的鉴定提供了一种准确度高、灵敏度好、具有重现性的工具。目前,这种方法作为一种特性分析法被很多研究单位和实验室采用(Herrmann et al,2001;Fouchier et al,2005)。然而,DNA测序是一项昂贵而且耗时耗力的工作,另外,五套全引物被应用到NA全部序列的扩增,很难挑选到合适的引物。因此,研究一种快速、敏感的NA分型方法是必要的。

      在过去十年中,许多报告表明使用基于PCR的诊断测试的优越性(Li et al.,2001;Poddar,2002;Kessler et al,2004)。RT-PCR已经被应用于鉴别NA1-NA5(Lee et al,2001)和HA1和HA2(Stockton et al,1998)。PCR方法被认为是鉴别HA、NA亚型的最敏感、特异性最高的方法之一(Schweiger et al,2000;Hoffmann et al.,2001;Horimoto and Kawaoka,1995)。

      虽然亚型特异性引物已被用来区分N1-N9病毒,但是由于GenBank中可用的NA引物序列有限,使得检测结果不太良好或者检测不出。近年来,大规模的完整NA序列已经向GenBank递交。因此,尝试构建RT-PCR的方法快速、敏捷的区分AIVs是对常规方法的一种补充。

      2、材料和方法

      2.1   病毒

      本研究一共考察了101份毒株(表1),分别由中国农业大学兽医学院和扬州大学兽医学院提供。所有病毒采用9日龄鸡胚繁殖,提取尿囊液于-70度储存备用。

      2.2   病毒分型的常规方法

      101份毒株的HA亚型采用先前提到的HI抗体血清反应进行分辨,NA亚型采用序列分析进行分辨。简而言之,这些病毒的NA基因通过PCR扩增后,扩增产物被克隆到pGEM-T载体中,NA的亚型通过在NCBI上病毒核苷酸序列的BLAST搜索而得到分辨。本次研究的NA基因序列已经上传到GenBank。

      2.3   RT-PCR引物

      为了设计NA的RT-PCR特异性引物,在GenBank中找到了509个完整的NA序列及AIVs所有的NA亚型序列并对他们进行分析。这些NA基因的核苷酸序列通过LASERGENE试剂盒运用Clustal V的方法进行比对。(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)。通过序列分析和比对,九对特异的NA基因引物被设计,并且每个引物都是针对相应的NA基因型设计的。引物的特性通过Primer Premier 5.0进行了分析,设计的引物如表2:

      2.4   cDNA的合成

      病毒RNA是通过氯仿提取和异丙醇沉淀得到,如前所述(Lu et al., 2005; Lee et al., 2001)。300ul尿囊液加到600ulTRIzol试剂混匀,室温反应5min,然后用300ul氯仿提取。经过12000r/min离心15min,水相转移到一个干净的试管并于等体积的异丙醇混合,于-20°下反应30min,通过12000r/min离心15min,弃上清液,RNA被沉淀,用75%的乙醇清洗,溶解于35ul DEPC水。用AMV反转录酶和Uni12引物进行反转录,得到的cDNA于-20度保存。

      2.5   RT-PCR分型

      在一套试管组中同时对每一个病毒进行九个独立的PCR反应,反应所采用的引物如表2所示。25ul的反应体系如下:

      2.5ul 10×PCR buffer (Mg2+ plus, TaKaRa, Dalian, China)

      0.5ul dNTPs(10mM each, TaKaRa, Dalian, China)

      0.5ul rTaq DNA聚合酶(5 units/ul, TaKaRa, Dalian, China)

      1ul 引物(25uM)

      3ul cDNA溶液

      最后加双蒸水至25ul

      PCR反应设置如下:

      94°5min——94°40s、60°40s、72°40s(30个循环)——72°10min

      PCR产物通过溴化乙啶染色和琼脂糖凝胶电泳后被检测。

      2.6   DNA序列的扩增

      为了评估特异性扩增产物的准确性,一套NA亚型扩增的核苷酸序列被检测。其PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后,应用DNA纯化试剂盒,克隆到载体进行测序。通过对比序列分析产物的同源性和准确性。

      3、结果

      为了建立一种快速鉴别AVIs的NA亚型的RT-PCR方法,在分析GenBank中509个NA基因的基础上设计了9对引物,他们概括了NA的所有基因型。每一对引物针对于相对应的NA亚型是特异的,其PCR产物在246—663bp之间,根据NA亚型。RNA病毒是通过接种鸡胚繁殖的,9个RT-PCR中只会有1个与NA亚型大小相对应。

      RT-PCR参数最优化,60°是获得最大产量的最佳退火温度,最重要的是,NA亚型的PCR是在同一个循环条件下进行。NA特异亚型能够同步同一进行扩增,AVIs的NA亚型能在5h内鉴别出来。

      为了确定引物和该反应系统是否在不同的年份同样适合流感病毒亚型的分离,101份毒株中有95份在2000—2007年之间收集,另外6份来自病毒扩增。该方法的特异性和敏感性通过每一个亚型标准模版的RT-PCR进行检测。101份样品中92份毒株的检测是成功的,只有单一的电泳条带出现。然而,还有9份的结果不是很理想,其中3份没有条带出现,6份的特异性和非特异性条带都出现了。只要出现条带就是敏感的,所以NA亚型RT-PCR分型的敏感性为97.3%(98/101),特异性为91.1%(92/101)。

      为了更好的评估这些引物的特异性,引物的扩增产物进行DNA测序。通过与全段NA基因进行比较,证明引物是非常合适的。

      4、讨论

      尽管有各种技术可用于检测分离禽流感病毒,但相信,PCR技术是最具敏感性和特异性的检测分离方法(Schweiger et al.,2000; Hoffmann et al., 2001;Horimoto and Kawaoka,1995)。PCR方法(包括RT-PCR、即时PCR、多重PCR、荧光PCR和巢式PCR)已经用于AVIs的分型并取得很好的效果(Lee et al., 2001; Hindiyeh et al., 2005; Fouchieret al., 2000;Schweiger et al., 2000; Herrmann et al., 2001; Ellis and Zambon,2001; Phipps et al., 2004; Habib-Bein et al.,2003)。但是,他们主要集中在小范围的亚型或者只是针对15个HA的亚型。迄今为止,还没有报道过成功地用RT-PCR的方法分离出AVIs的NA1—NA9亚型。本研究的目的正是找出一种特异性好、敏感性好的RT-PCR方法来分离AVIs的NA亚型。

      选择合适合适的引物序列是决定RT-PCR方法敏感度和特异性的重要因素(Hoffmann et al.,2001)。从理论上讲,扩增的序列越长,单个NA亚型的病毒就越保守。经过考察GenBank中所有NA基因全序列,大概有十多个基因全序列被考虑分为亚型。另外,这些所有被考察的序列都是来自不同时间空间的鸟类宿主。因此,这些引物将可以被应用于所有不知名病毒的以上亚型RT-PCR扩增中。所有NA亚型的引物对应其NA基因都有高度保守序列,扩增片段大小从246—633bp,本研究应用琼脂糖凝胶电泳区分NA基因型,能够用于实验室操作,既不需要即时PCR也不需要测序设施。


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