其他工具酶类：鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性研究

　　鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）与胰蛋白酶的底物特异性类似，但其热稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶，可作为胰蛋白酶替代品。另外，在鱼糜加工过程中，MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因之一。因此，对鱼类MBSP的重组表达及其酶学特性研究，可为开发MBSP作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶及研制鱼类MBSP抑制剂提供理论依据。

　　本文以淡水鲫鱼为研究对象，以鲫鱼肌肉中总RNA为模板，采用RT-PCR技术获得了鲫鱼MBSP基因（MBSP）片段，其开放阅读框为729bp，编码242个氨基酸残基，在其N-末端存在一个含20个氨基酸残基的信号肽。因此，成熟鲫鱼MBSP基因（MBSP2）大小为669bp，编码222个氨基酸残基。通过基因重组技术将成熟鲫鱼MBSP基因片段（MBSP2）整合到毕赤酵母的染色体上，成功构建了重组酵母表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP2。将该菌株在摇瓶中用1.0%甲醇进行诱导表达，在发酵液上清中可检测到分子量约36kDa的重组蛋白。Western blotting鉴定该重组蛋白为重组鲫鱼MBSP。同时，PAS染色证明了该重组鲫鱼MBSP为糖蛋白。

　　在7L发酵罐中对重组酵母表达菌株GS115/pPIC9k-MBSP2进行高密度发酵，获得其适宜的工艺条件为：发酵温度在28.5-29.5℃之间、pH范围在5.2-5.8之间、溶氧量保持在30%以上、流加方式为溶氧控制、间断补加甲醇诱导32h。发酵结束时，发酵液OD600可达56.2，菌体湿重为123.9g/L。通过对不同分离纯化技术进行合理组合及其工艺条件的优化，建立了一套重组鲫鱼MBSP的分离纯化工艺流程：7L发酵罐中发酵→离心取发酵液上清→30-60%硫酸铵沉淀→透析→Q-Sepharose阴离子交换层析→超滤脱盐及浓缩→冷冻干燥。最终获得了重组鲫鱼MBSP的固体产品，可用于酶学性质分析及其应用研究。

　　重组鲫鱼MBSP的酶学性质研究包括底物特异性、最适温度和温度稳定性、最适pH和酸碱稳定性、酶抑制剂和金属离子对其酶活的影响。底物特异性研究表明，重组鲫鱼MBSP可水解蛋白质中赖氨酸的羧基端肽键，而不识别精氨酸残基，这与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的水解特性相类似；其最适反应温度和pH分别为55℃和pH7.5；该酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性；丝氨酸蛋白酶抑制剂及高浓度金属离子可显著抑制其活性。此外，重组鲫鱼MBSP能快速降解鲫鱼肌原纤维蛋白，这与天然鲫鱼MBSP特性类似。

　　将重组鲫鱼MBSP与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的酶学性质进行比较。结果表明，重组鲫鱼MBSP具有热稳定性高、pH适用范围宽、对底物的亲和力强及反应速度快等优势。另外，重组鲫鱼MBSP能有效降解如牛血清白蛋白（BSA）和精氨酸激酶等典型蛋白质。因此，重组鲫鱼MBSP有望作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶。