N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHL内酯酶)是一类特异性降解AHL类信号分子的金属蛋白水解酶，广泛存在于多种微生物中。近年来AHL内酯酶作为一种新型抗菌策略（群体感应淬灭策略）的工具酶而成为研究的热点。在水产养殖中，哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是重要的致病菌，研究表明这两种弧菌的毒力因子受其群体感应(quorum sensing，QS)系统的调控，但调控机制尚未阐明。本研究的目的是利用原核系统高效表达AHL内酯酶，研究其酶学特征，并将该酶以酶制剂的形式与弧菌培养后探讨弧菌毒力基因的响应机制。
本研究从一株具细菌群体感应AHL信号分子淬灭活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SS6中扩增N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserinelactonase，AiiA)基因aiiASS6，生物信息学分析显示aiiASS6(GenBank: KP125494)编码一条含有297个氨基酸残基的多肽，AiiASS6的氨基酸序列含有N-酰基高丝氨酸内酯酶典型的“HXH”基序和194位的Tyr残基。将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28(a)进行异源表达，构建重组菌株并提纯目的蛋白AiiASS6;然后用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）技术分析目的蛋白AiiASS6降解AHL信号分子N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone（OOHL）的酶学特性。HPLC检测结果表明AiiASS6对OOHL具有很强的催化活性及耐热性，Km和Vmax分别为0.998 mmol/L和22.3 U/mg，最适pH为7.6，最适温度范围为50℃～90℃;此酶在4℃保存3个月后其残余活性仍达到86％，表现出较强的稳定性，表明它具有作为微生物制剂防控植物或水产养殖中基于QS调控的病原菌毒力的应用潜力。
利用提纯的AHL内酯酶AiiASS6研究群体感应淬灭酶对弧菌毒力表达的影响机制，主要技术手段是实时荧光定量PCR。将AHL内酯酶AiiASS6分别与哈维氏弧菌和副溶血弧菌共培养处理后，利用荧光定量PCR，检测哈维氏弧菌及副溶血弧菌的相关毒力基因和内参基因在经过群体感应淬灭酶AiiASS6处理后的表达差异。从哈维氏弧菌VH12和副溶血弧菌1.1997的基因组中分别扩增出毒力基因tlh、vhhA和tlh、tdh，进行TA克隆，与内参基因rpoA一起进行荧光定量PCR扩增构建标准曲线，实验得到的目的基因和内参基因的标准曲线回归系数均大于0.99，有很好的线性关系;熔解曲线分析显示目的基因和内参基因的熔解温度均一，峰形较为锐利，荧光定量PCR扩增产物特异性良好。对各处理样品进行荧光定量PCR检测发现，在AHL内酯酶AiiASS6与弧菌共培养后，哈维氏弧菌的tlh、vhhA基因和副溶血弧菌tlh、tdh基因的表达量均显示为下调，下调量也有很大的差别，表明AHL内酯酶能够干扰弧菌QS系统，并且对其毒力基因的表达水平具有正调控作用。
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