SPE固相萃取技术(仪器装置)(八)之如何建立固相萃取方法

文/ 发布于2018-12-25 浏览次数:251

  如何建立固相萃取方法

  6.1固相萃取基本步骤

  固相萃取的步骤视萃取机理及检测手段可多可少。对于反相固相萃取柱而言,其基本步骤有五步:

  - 固相萃取柱预处理

  - 样品添加

  - 固相萃取柱洗涤

  - 固相萃取柱干燥

  - 目标物洗脱

  固相萃取柱预处理

  无论是自行装填的还是商品化的固相萃取柱在使用之前都是以干燥的状态存在的。如同新购置的HPLC柱一样,在使用时都必须先对柱子进行活化、平衡。对于反相固相萃取柱而言,进行柱子预处理的主要目的有两个:

  对固相柱进行活化,展开碳氢链增加和分析物作用的表面积。

  对固相柱进行清洗,除去柱上吸附的对分析有影响的杂质。

  在具体操作上,一般程序是:先用甲醇或极性有机溶剂淋洗柱子,然后再用水或缓冲溶剂除去多余的有机溶剂。因为上述有机溶剂都是良好的洗脱剂,过多的存在会使目标化合物在吸附过程中损失。当用离子交换 SPE 时, 必须注意系统的pH。其pH值应该与样品保持一致。如果使用的是手工的操作方法,必须注意在加样于固相柱前已处理好的固相萃取柱必需保持湿润。 这点对于非高聚物的固相萃取柱尤为重要。否则会出现回收率低、重现性差的结果。

  样品添加

  将样品添加于固相柱中,用正压或负压使样品通过柱子。样品的流速必须控制。慢流速有利于对目标化合物的吸附。但是,流速过慢会增加整个萃取过程的时间,降低样品处理的通量。另外,过慢的流速会造成杂质被吸附的机会增加,对目标化合物的检测分析不利。 一般对于100毫克填料的SPE柱流速在5-10 ml/min。对于以离子交换为作用机理的萃取,样品通过SPE柱的速度应该适当的降低,以保证分析物有足够的时间与SPE柱填料的离子交换功能团发生作用一般控制在1.5-5 ml/min。

  固相萃取柱洗涤

  为了减少分析时杂质对目标化合物的干扰,延长仪器的使用寿命,应该尽可能地除去干扰物。因此,在固相萃取中经常会通过对固相萃取柱的洗涤来达到这个目的。选用适当的洗涤剂选择性地洗脱吸附力弱杂质而保留分析物于柱上。洗涤剂的选择也取决于最后的分析手段。不同的检测手段对样品的“干净”程度也不同。

  固相萃取柱干燥

  如最后的洗脱剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂,而分析手段为反相 HPLC,固相柱上的残留水对分析影响不大。但是,当水溶性差的有机溶剂为洗脱剂或分析手段为GC或GC-MS时,固相萃取柱的干燥就特别重要。水溶性差的有机溶剂作为目标物的洗脱溶液时,水的存在会直接影响洗脱效率。而样品中大量水分的存在将对GC分析柱造成致命性的损害。

  目标物洗脱

  目标化合物的洗脱在整个固相萃取过程中是至关重要的最后一步。为了最大限度地将目标化合物洗脱下来,必须选择适当的洗脱溶剂。选择洗脱溶剂时必须考虑以下几个因素:

  洗脱剂必需有足够强度,以最小用量将分析物洗脱下来。洗脱剂必需有足够的选择性只将分析物洗脱,而将吸附力强的杂质保留在柱上。

  在选择洗脱溶剂时,可以通过改变溶剂的极性指数、溶剂强度、溶剂选择性来达到最好的分离效果。

  洗脱溶剂通过柱子的流速也必须控制。流速慢有利于目标化合物的洗脱。但是,会增加萃取时间,降低效率;同时,过慢的流速可能会造成最后洗脱馏分中杂质的增加,对检测分析不利。

  6.2相关信息的汇集

  要建立一个好的固相萃取方法应该综合考虑许多因素。其中首先要做的就是汇集所有可能得到的信息。这些信息主要包括:

  目标化合物

  - 化学结构

  - 可生成离子化合物的pKa

  - 浓度

  - 估计样品体积

  - 溶解度

  - 稳定性

  样品基质

  - 基质的类型

  - pH值及离子强度

  - 对目标化合物萃取的干扰

  分析手段

  - 最终的分析手段

  - 分析方法可使用的溶剂

  - 现有的HPLC方法

  在具体实施中可以通过填写下列表格来确定初步的固相萃取参数:

  6.3固相萃取材料的选择

  在选择固相萃取柱时,首先要考虑的是选择哪种萃取机理对目标化合物进行萃取。以下是根据萃取机理选择萃取填料类型的示意图:

  根据化合物的lg Kow选择固相萃取材料

  辛醇-水分配系数 Kow 是有机化合物在辛醇和水两相平衡浓度比,Kow反映了该有机化合物的亲脂性或亲水性的程度。在固相萃取中,可以根据 lgKow 的大小来选择固相萃取柱。通常,lgKow>3为非极性化合物;lgKow在1-3之间为中等极性化合物;lgKow<1为极性化合物;lgKow<0为水溶性化合物。

  6.4选择固相萃取溶剂

  溶剂的选择一般包括两个方面:洗涤溶剂的选择和洗脱溶剂的选择。

  对于洗涤溶剂而言,我们希望的洗涤溶剂能够最大限度地将可能对目标化合物分析及对检测仪器带来干扰及损害的物质除去。同时,又能最大限度地保证分析物在洗涤过程中不会有明显的损失。下表是选择洗涤溶液的一些基本原则。

  洗脱溶液用于将目标化合物从固相萃取柱上洗脱下来。

  固相萃取中常见溶剂的性质

  6.5选择固相萃取的流速

  在固相萃取过程中,有三个步骤涉及到液体通过固相萃取柱的流速:样品过柱、洗涤及洗脱。其中,样品过柱的流速及洗脱液过柱的流速对结果的影响较大。

  样品过柱的流速的选择可以参考下表:

  洗脱溶剂的流速与洗脱溶剂的用量有关。溶剂用量大,溶剂过柱的流速可以加快。但是一般的洗脱原则是洗脱溶剂的体积越小越好。因为洗脱溶剂体积小,有利于洗脱物的后处理。如减少浓缩时间或无需浓缩。

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