C18色谱柱的选用、保养与维修

文/ 发布于2018-12-25 浏览次数:142

  据统计,近80%的有机物及无机物可以用高效液相色谱法进行分离,其中反相色谱中的C18色谱柱是高效液相色谱中最为常用的一类色谱柱。下面就C18色谱柱的选用、保养与维修作一介绍。

  1、选用

  C18的选用主要考虑2个问题,即柱填料和柱规格对色谱柱的影响。

  1.1 C18柱的填料对色谱柱的影响

  柱填料的物理性能对填料色谱行为有重要影响。填料主要的物理性能包括如下:颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。

  (1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的大小。实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值。如粒径“5μm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5μm,实际上有一个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作用。一般来说,平均颗粒度越小,颗粒分布度越小,色谱柱效越高,反压亦越高。目前C18柱填料粒径在4~10μm之间。

  (2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是指填料的平均孔径。球形填料装柱后平均孔径分布比较窄,柱床结构均匀,柱效高,重现性好;无定形填料平均孔径分布较宽,柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀,谱带扩宽。平均孔径的大小对分离大分子化合物有较大的影响,在分离含有较大分子的样品时可能会有分子排阻效应,或产生吸附效应从而影响定量的回收率及准确度。因而在用反相色谱分离诸如蛋白或多肽样品时应考虑选用大孔径(如30 nm)的反相柱填料。孔体积作为硅胶多孔性的参数,在分离分析较大分子化合物时可作参考,选用较大孔体积的反相柱填料。

  (3)化学键合相填料在高效液相色谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较大的有机基团,采用极性较小的溶剂作流动相。亦可键合极性较小的有机基团,选用极性较大的溶剂作流动相。C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的,这类键合反应目前应用最为普遍。如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相,商品名为M-Bondapak-C18

  (4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂,然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加,柱子的保留值增加。键合相的色谱行为与键合密度有关,也与硅胶的密度及填料的表面积有关,填料的密度越高,填柱所需的硅胶量越多,柱子的含碳量也越高。如果用2种不同密度相同碳含量的填料填充柱子,其保留行为将明显不同。因此,单独以碳含量来预测色谱行为是不够的。

  (5)C18硅烷化试剂是一个大于2 nm大分子,因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体位阻。其结果导致在硅胶表面有大量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应,这些极性的硅醇基在一定色谱条件下会与碱性化合物相互作用引起峰形拖尾,从而可影响定量分析结果。这些问题在一定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独立反应,以减少在硅胶表面的硅醇基。烷基化处理采用小分子(如三甲硅烷)的试剂,其空间位阻远小于C18基团。大多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。据报道,通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件,最高的覆盖量可达50%。很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。表面上看C18柱虽然化学官能团相同,而实际上不同品牌的C18柱性能可能有很大差别,从而产生不同的分离结果。

  1.2 C18柱的规格对色谱柱的影响

  柱填料的选择关系到色谱分离的可能性,而柱规格的选择直接影响分析速度、分离能力、检测能力及每次分析的溶剂消耗等。柱规格包括两方面:柱内径和柱长度。柱内径,分析型一般为2~6 mm,制备型20 mm,大者可达80 mm;柱长度,分析型5~30 cm,制备型15~50 cm。一般来说,柱内径不影响分离度与分析时间的关系。今天,柱技术已发展到不同柱内径的柱子能够具有相同的性能。不同内径的柱子又各具特点,对相同的分析时间和分离度来说,内径大的柱子比内径小的柱子多消耗溶剂。另一方面,较小内径的柱子对相同的检测信号来说所需样品量亦较少。因此,在样品量有限时,可使用小内径柱。柱长度增加虽可改善分离效果,但阻力也随之增加,必须提高入口压力。柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍。分离度、分析时间及柱压三者相互制约,选择好其中两者,则第3个因素也就选好了。长柱可以给出高分离度,短柱可提供快速分离,我们可以根据样品情况去选用合适的色谱柱

  1.3 C18柱选用的基本原则

  (1)选用经过烷基化处理封口的填料可防止碱性化合物的拖尾现象。

  (2)选用含碳量高的柱子,增加保留值。

  (3)选用较短的柱子(如15 cm,7.5 cm)。

  (4)选用小颗粒度的填料。

  (5)对分子量大的组分选用大孔径填料的柱子。

  2、日常使用和维护

  在日常分离分析工作中,色谱柱使用是否得当,直接影响色谱柱的寿命。下面介绍C18柱在日常使用过程中应注意的事项。

  (1)柱子在装卸、更换时,动作要轻,接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动,以免柱床产生空隙。

  (2)如果仪器用来做常规分析,样品种类有限,但分析次数多,则不妨为每一类常规分析配置1根专用柱,这样有助于延长柱子的寿命。

  (3)如使用柱温控制装置时,应注意在通入流动相后才能升温。

  (4)流动相使用前需进行脱气处理,以免降低柱效和影响检测等。样品溶液需经适当的前处理及过滤,以减少柱污染和堵塞。

  (5)在更换流动相种类时,应注意溶剂的互溶性,防止发生盐析现象。

  (6)柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力,最好在最高压力一半以下。一般不超过20 593.965~29 419.95 kPa。在低压力(≤14 709.975 kPa)的范围使用,可使柱保持长时期的高柱效。

  (7)C18色谱柱属非极性键合相色谱柱,流动相的pH值应严格控制在2~7之间,以免损坏柱子。

  (8)在完成分离分析工作之后,不应立即停机,需及时对色谱分析系统进行冲洗,一般0.5 h以上,以除去色谱柱内的杂质。

  (9)如果流动相中有盐类,首先用水充分清洗。如果是胺类(如三甲胺类或四丁基胺类)添加到流动相中,要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶剂冲洗,不要只用水冲洗。

  (10)C18一般用100%甲醇作为保存溶剂,以防柱子干裂而损坏。严禁水或缓冲溶液长时间在色谱流路中保留。

  (11)选用合适的C18保护柱,以保护分析柱免受杂质颗粒及不可逆吸附的干扰物的影响。保护柱内装填料颗粒度应与分析柱填料的颗粒度尽量一致。

  (12)柱的保存期不宜太长。短期不用的C18柱,用甲醇冲洗30~60 min,然后将柱两端密封。较长期不用的柱子,一是采取定期冲洗,再密封的方法;二是在冲洗后,柱两端各装1只有一定容量的灌满甲醇的容器(只装一端也可),以补充在较长存放期间柱内溶剂的蒸发。

  3、维修

  色谱柱在日常使用过程中,尽管保护严格,样品和流动相尽管经过前处理,但经过长时间的使用,仍然难以完全避免柱子受到污染,固定相流失、板结、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通过维修,使部分柱效恢复。

  3.1 柱污染再生技术

  色谱柱污染后,可以用合适的溶剂冲洗,使柱效再生。C18柱常规的再生洗涤方法是:分别用甲醇、三氯甲烷、甲醇/水各60 mL依次通过色谱柱,再用100%甲醇60 mL平衡色谱柱后封存,柱效将恢复正常。必要时,根据柱污染性质(如有机污染、盐类污染等),采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA钠盐冲洗,然后再用水冲洗,最后用100%甲醇平衡色谱柱后封存。对于严重污染的C18柱,可采用水、甲醇、氯仿、乙烷依次冲洗后,按顺序倒过来再冲洗1次,每次所用溶剂60 mL,不接检测器,最后用100%甲醇平衡色谱柱封存。

  3.2 柱污染的修复

  在柱污染再生无效或已知柱污染严重时,可以采用柱修补的方法解决,但柱污染深度不宜超过5 mm。方法是将特制小铲将污染部分挖去,再用与柱填料相同的固定相与流动相混合制成浆状,然后将浆状固定相仔细补入被挖去的部分(尽量使后填补的固定相接近原装的紧密程度),修平端面即可。修好的柱子如果柱头两端的筛板的孔径是一致的,可将柱子颠倒过来使用一般时间,目的是借助流动相冲洗作用,恢复柱床紧密程度。

  3.3 柱塌陷的修复

  柱塌陷的原因很多。对于塌陷不太严重时,如果柱头两端的筛板孔径是一致的,可将柱颠倒使用一般时间,即可恢复性能。当塌陷严重(5、mm左右)时,可采用柱污染的修复方法修补即可。

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  一般说来哪里进空气了,不同的地方处理不一样的哦。

  系统里气泡的排出:打开Purge阀,再移去色谱柱,然后用较大流速冲洗,直至气泡排尽,如果不行,则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。注意液相脱气机的情况,膜式脱气机用注射器抽的话可能造成脱气机损坏。鉴于用注射器抽的话可能损坏脱气机,建议先采取小流速流动相冲洗2~3h,一般可以解决问题。色谱柱里也进了空气的话:把柱子出口端拧开低流速排净柱子中的气泡。

  高效液相色谱仪怎么排空气?

  一般操作规程为:(参考)

  1、准备好流动相,经 0.45 微米滤膜过滤,脱气后,转入相应的储液瓶。打开输液泵的参比阀,抽尽管路中的气泡,关闭抽气阀。

  2、打开仪器有关的电源开关,待自检完毕,再开启电脑,进入 Windows操作系统,运行色谱工作站。

  3、使泵的参比阀保持开启状态,以 0.1mL/min 的流速进行几分钟,再逐渐将流速提高到 7~8mL/min,打开抽气阀,往其中慢慢推入 5~10mL 甲醇水( 40/60)混 合溶液,排除泵中的气泡,关 闭抽气阀。将 流速降到 0.1mL/min。

  4、关闭参比阀,逐渐将流速提高到所需的值。

  5、待分析样品经 0.45 微米滤膜过滤。

  6、设定好有关参数,待色谱柱充分平衡后,进样分离测定。

  7、测定完毕后,用纯水冲洗色谱柱 30、分钟,再用合适的溶剂冲洗色谱柱。

  8、退出色谱工作站,关闭电脑和仪器有关的电源开关。

  9、在仪器使用过程中,流速的改变必须逐步进行,禁止突然升高或降低,以免损害色谱柱和输液泵。

  流动相内有气泡 关闭泵 打开排空阀 按PURGE 键 清洗脱气 ,气泡不断的从过滤器冒出 , 进入流动相 , 无论打开PURGE 键几次 都无法清除不断产生的气泡。

  原因:过滤器长期沉浸于水液内 ,过滤头内部由于霉菌的生长繁殖 ,形成菌团阻塞了过滤器, 缓冲液难以流畅的通过过滤头 , 空气在泵的压力下经过过滤器进入流动相.处理过滤头浸泡在5%的硝酸溶液内 , 超声清洗十五分钟即可; 亦可将过滤头浸泡在5%的硝酸溶液中12-36小时 , 轻轻震荡几次 , 再将过滤器用纯水清洗几次, 打开排空阀 ,打开PURGE键清洗脱气如仍有气泡不断从过滤器冒出, 继续将过滤器浸泡在5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团以被硝酸破坏,流动相可以流畅的通过过滤器,打开排空阀,打开泵流速调治1.0-3.0mL/min, 纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净 。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。

  故障:色谱柱压高

  原因:

  (1)缓冲液盐份如(乙酸铵等)沉积柱内;

  (2)样品污染沉积.

  处理对于第一种情况先用40-50度的纯水 , 低速正向冲洗柱子待柱压逐渐下降后 相应的提高流速冲洗柱压大幅度下降后 用常温纯水冲洗 , 之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟 , 对于第2种情况 ,由样品的沉积引起污染的C18柱 , 和纯水反向冲洗柱子 ,然后换成甲醇冲洗 , 接着用甲醇+异丙醇[4+6]冲洗柱子[冲洗时间的长短由样品的污染情况而定] , 在用换成甲醇冲洗 , 然后用纯水冲洗 ,最后甲醇冲洗,正向冲洗柱子30分钟以上。

  高效液相色谱仪既无压力指示又无液体流过

  故障:既无压力指示 又无液体流过

  原因:

  1、泵密封垫圈磨损

  2、大量气体进入泵体.

  处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处不帮助抽出空气.。

  系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间家有异物,使得两者不能密封.

  处理:工作中注意流动相的量.保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气.如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。

  高效液相色仪故障:

  出峰不准,峰分叉。

  原因:

  (1)色谱柱被污染,(2)柱头填料塌陷。

  处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后再用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上.如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况.对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷.去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与助内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平.柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。

  高效液相色谱仪故障:

  峰面积重复性不佳。

  原因:

  (1)进样阀漏夜;

  (2)加样针不到位.

  处理;对于第一种情况更换进样垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速,平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确.日常生活中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲溶液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱住的使用寿命,同时避免注射过量浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱住作好标记,用于不同分析目的的色谱住不要混用等。

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