通过比较细胞培养上清和未用于细胞培养而成分完全相同的培养液二者的支原体特异性酶的含量，即可知道培养的细胞是否被支原体污染。
产品优点
《发光法支原体检测试剂盒》具有如下显著的优点：
1、检测时间短。整个检测过程只需30分钟左右。
2、《发光法支原体检测试剂盒》检测的是活支原体，只有样品中存在活的支原体，才会生产阳性结果，可以区分支原体的死活。而《一步法恒温支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》都是检测支原体的DNA，不论支原体的死活，样品中只要有支原体DNA的存在，就会生产阳性结果，所以无法区分支原体的死活。细胞培养中，最关心的是细胞培养液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原体。而如果仅有死的支原体或者一些残存的支原体DNA，是无关紧要的。
3、不存在假阳性。由于《一步法恒温支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》都需要对支原体DNA进行大量的扩增，检测过程中，只要有微量的支原体DNA或者扩增产物的污染，就会出现假阳性。而《发光法支原体检测试剂盒》只检测活的支原体，不存在扩增产物污染样品的问题。
4、不存在因反应被抑制导致的假阴性。由于细胞培养数天后，培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物，所以使用《PCR法支原体检测试剂盒》经常会出现假阴性的问题。该问题在《发光法支原体检测试剂盒》不存在。
5、《发光法支原体检测试剂盒》对支原体的识别率极高，近20种细胞培养中出现过的支原体全部含有该酶，所以这些支原体全部可以被《发光法支原体检测试剂盒》识别。目前为止，100多种已知的支原体中，只发现这一种支原体不含有该酶，而这种支原体在细胞培养中出现的概率几乎为零，所以该方法支原体的识别率应该在99.99%以上。
试剂盒组成
1、支原体检测溶液：5.5 mL
2、试剂A(已冻干)：2.5 mL（50次检测）
3、试剂B(已冻干): 2.5 mL（50次检测）
注意：本试剂盒不含阳性对照，阳性对照需要单独购买（货号：LPC10，规格20次）。
检测过程
1、检测试剂的分装和保存
收到的产品为冻干品，溶解前，请放-80 ℃冰箱低温保存。第一次使用前，在冰上操作，分别用2.5 mL支原体检测溶液溶解试剂A和试剂B, 按每管50 μL分别分装到50个1.5 mL离心管中，立即放-80 ℃冰箱低温保存。
2、阴性对照的设置
本试剂盒每次检测都必须设置阴性对照。阴性对照必须使用配制完后放于4℃冰箱，未用于细胞培养但成分完全相同的培养液，包括其中的血清、抗生素等含量也必须完全相同。特别是其中的血清含量和批次，对发光的本底值影响很大，作为阴性对照的培养液，其中添加的血清，必须与用于细胞培养的血清批次相同且含量完全相同。例如：如果用于细胞培养的培养液为含有10%的胎牛血清的高糖DMEM，那么阴性对照也应该使用含有相同批次的10%的胎牛血清的高糖DMEM。如果用于细胞培养的培养液为无血清培养液，那么阴性对照也应该使用无血清但成分相同的培养液。
上述阴性对照的选取是按照最严格的方式进行的，如果确实没有成分完全相同的培养液，也可以使用成分最接近的培养液，比如血清批次可以不同。但是，基础培养基（比如DMEM等）一定要相同，虽然批次也可以不同。
3、阳性对照的设置
如果您实验室拥有经其他支原体检测方法（比如本公司的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《PCR法支原体检测试剂盒》等）检测为阳性的细胞系，其培养3天后的上清即可以直接按照后文的样品准备方法，自己制备阳性对照。
如果您没有上述阳性样品，那么阳性对照也可以从我们公司单独购买（货号：LPC10，规格20次）。
4、待测样品的准备
为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养3天（注：培养3天是最可靠的做法。当然，如果支原体污染比较严重，培养1-2天也可以满足检测的需要）且汇合度在70-90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长3天再取培养液进行检测。具体操作如下（请严格按照相应的体积进行操作）：
（1）取180 μL上述待测样品，在普通台式离心机上200 g（大约1500 rpm）低速离心5 分钟，准确吸取离心后的上清120 μL到一个新的1.5 mL离心管内，丢弃含细胞沉淀的原有离心管。
注意：本步骤为样品检测之前必不可少的步骤，低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其对支原体检测的干扰。所以离心力要严格控制在200 g左右，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，可能导致假阴性。而如果错误使用更低的离心力将可能导致哺乳动物细胞不能被离心沉淀下来，从而导致支原体检测时，哺乳动物细胞内的ATP也被释放到溶液中，可能导致假阳性。
（2）将含有120 μL上清的新的1.5 mL离心管，在普通台式离心机上16000 g (大约13000 rpm)高速离心3 分钟，小心吸走108 μL离心后的上清并丢弃（注意：切勿让吸头碰到离心管底部，因为底部为可能含有支原体的沉淀。留下大约12 μL培养液的目的也是为了防止吸头碰到离心管底部而将可能含有支原体的沉淀吸走）。往离心管内，加入108 μL作为阴性对照的培养液，并上下吹吸10次，将可能含有支原体的沉淀吹打均匀。至此，该样品方可用于后续的支原体检测。
注意：本步骤也是样品检测之前必不可少的步骤，高速离心是为了将支原体沉淀下来，而将培养液替换成阴性对照的培养液是为了排除一些细胞代谢产物对后续检测的可能干扰。
5、待测样品的保存
收集并经过低速离心去除细胞和经过高速离心替换成阴性对照培养液的待测样品，如果不是当天立即检测，请放于-80℃冰箱保存，不得放于室温、4 ℃或-20 ℃冰箱。样品在-80℃可以保存至少2年。
注意：（1）为了日后检测方便，应该同时冻存一些作为阴性对照的培养液。（2）未经过低速离心去除细胞和未经过高速离心替换成阴性对照培养液的待测样品，不得直接放-80℃冰箱保存。（3）经我们最新测试表明，经过低速离心去除细胞的样品即可直接放-80℃冰箱保存，后续高速离心替换成阴性对照培养液的步骤，可以在发光检测时，从-80℃冰箱取出融化后，统一进行。
6、根据待检测的样品、阴性对照和阳性对照的数量，从-80 ℃冰箱取出相应数量的试剂A和试剂B，放室温1-5分钟（注意：不能加热融化），等其融化立即后放冰上待用。
注意：试剂A和试剂B只能在每次检测之前从-80 ℃冰箱取出的，融解后在室温放置的时间尽可能的短，不能超过10分钟。融解后，放冰上的时间也最好不超1小时。已经融化后的试剂A和试剂B不能再次冻存使用。
7、吸取50 μL阴性对照、阳性对照或者已经经过低速离心去除细胞和经过高速离心替换成阴性对照的培养液的待测样品，放入黑色（优先选择）或者白色不透明的96孔板内，加入50 μL冰上放置的试剂A，室温反应15分钟。
注：不能使用透明的96孔板，否则孔与孔之间的发光值会互相干扰。
8、室温反应15分钟后，加入50 μL冰上放置的试剂B，室温反应3分钟后，在具有发光检测功能的多功能酶标仪或者单独的发光检测仪（Luminometer）上，以仪器默认的萤火虫荧光素酶（Luciferase）的发光检测参数进行发光值的检测，5分钟内，连续测5次阴性对照和待测样品的发光值，计算各自的平均值。
注意：（1）发光检测时，可以不用加载任何的滤光片或者使用萤火虫荧光素酶（Luciferase）最强的发光波长560 nm进行检测；（2）如果酶标仪的检测灵敏度可调，尽量让阴性对照的发光值大于1000；（3）如果样品是无血清细胞培养上清，相应的阴性对照培养基因不含血清，其发光值可能会比较低，甚至只有100左右的发光值，此时可以在阴性对照培养基中加入10%的胎牛血清或小牛血清，当然无血清细胞上清样品也必须用含10%的胎牛血清或小牛血清的阴性对照培养基进行替换（高速离心后替换，见上述步骤4）后，再进行检测。加入血清后一般可以明显提高阴性对照的发光值。
结果判断
计算待测样品的发光平均值与阴性对照的发光平均值的比值：
1、如果比值>1.2，说明待测样品有支原体污染（阳性）。严重的污染，该比值甚至可以达到10以上。
2、如果比值在1.1-1.2之间，说明待测样品可疑有支原体污染（可疑阳性）。但该样品需要继续培养24-48小时后，重新检测。如果继续培养24-48小时后，重新检测的比值仍然在1.1-1.2之间，应该判为阴性。
3、如果比值<1.1，说明待测样品无支原体污染（阴性）。
注意：以上比值只是一个经验值，如果同一个样品的5次发光值读数之间的差异小于10%，上述比值与污染之间的对应关系一般是正确的。如果同一个样品的5次发光值读数之间的差异大于10%，上述比值与污染之间的对应关系就未必正确。这时，比值接近检测下限的样品，就需要根据具体情况来确定是阴性还是阳性。
注意事项
1、本试剂盒只在96孔板进行过测试。因为发光值会随时间略有变化，如果使用单管的发光检测仪，尽量保证阴性对照和待测样品加入试剂A后的反应时间和加入试剂B后到发光值检测的反应时间相同。
2、本试剂盒灵敏度与30 cycles的PCＲ基本相当。
3、问：如果配制完后放于4℃冰箱未用于细胞培养且成分完全相同的培养液本身有支原体污染（比如加入的血清本身含支原体），是否仍然可以用作阴性对照？
答：可以。因为：即使作为阴性对照的培养液本身有支原体污染，其中的含量也是极其微量的。而待测样品是经过培养3天以上的，其支原体在这3天培养过程中，会大量繁殖，用《发光法支原体检测试剂盒》检测的发光值，肯定比阴性对照的发光值高得多。
4、本试剂盒与Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit的原理一样，可以替代后者用于细胞培养上清的支原体检测。
5、如发现细胞被支原体污染，本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂。
附录：如何检测血清是否含有支原体污染？
血清有没有支原体污染这是细胞培养用户非常关心的问题。其检测方法有相当的特殊性，现介绍如下：
1.必须认识到血清不适合直接检测，在对其进行检测之前，必须将其中可能含有的支原体进行大量的繁殖。这是因为：（1）商品化的血清都是经过0.1 μm的滤膜多次过滤的而且长期低温保存和运输，其中即使含有支原体，其含量也必然是极其微量的（比如1 mL就含有几个支原体），直接检测一般是检测不出来的；（2）如果不对其进行大量繁殖而直接用《一步法恒温支原体检测试剂盒》进行检测，由于该试剂盒灵敏度非常高，很多血清的检测结果会介于阳性和阴性之间。但是这也只能说明其含有微量的支原体DNA，不能说明其含有活的支原体。当然，如果检测结果与阳性对照完全一样，呈典型的蓝绿色，说明其支原体DNA的含量确实较高，也间接说明其血清质量较差，在其生产过程中，没有控制好支原体的污染。如果检测结果与阴性对照完全一样，呈典型的紫红色，也间接说明其血清质量较高。但是以上几种结果都不能直接说明该血清一定含有活的支原体或者一定不含有活的支原体。（3）血清往往含有抑制PCR扩增的成分，直接用PCR法进行检测也是无法准确判断的。
2.血清样品中支原体的繁殖方法：将1 mL的血清按1:10稀释到支原体液体培养基中【注意：（1）血清接种的量不能太小，一般接种不少于1 mL，否则可能漏检；（2）不能使用常规的哺乳动物细胞培养液代替支原体液体培养基。因为经我们测试：在没有动物细胞共培养的情况下，支原体在含10%血清的动物细胞培养液如DMEM、1640、 MEM、GMEM中繁殖非常缓慢，甚至完全不繁殖。】，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培养箱或者普通的细菌培养箱中培养3天【经我们测试3天的培养已经足够而且是最佳选择】。3天后，进行支原体的检测。
3.培养3天后的样品中支原体的检测方法，可以在本公司《发光法支原体检测试剂盒》、《一步法恒温支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》中任选1-3种进行检测。由于，血清是否含有支原体，事关重大，我们建议至少使用两种方法进行检测。
4.如果条件许可，我们建议其中一种方法尽量选择《发光法支原体检测试剂盒》，因为该方法可以区分支原体的死活，而且可以进行定量的分析，可以知道：培养3天后，支原体繁殖了多少倍。使用该方法，具体操作如下：以放4 ℃冰箱的含10%待测血清的支原体液体培养基作为阴性对照，用《发光法支原体检测试剂盒》检测培养箱中培养3天的培养液，其发光值是否明显增高，从而判断最初加入的血清是否含支原体。
5.当然，培养3天后的样品，也可以用《一步法恒温支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》进行检测。用这两种方法进行检测时，建议同时检测原液、1:10和1:100的稀释液，稀释液用PBS。这是因为：（1）原液仍然含有10%的血清，其仍然有可能抑制PCR的扩增；（2）一个样品同时检测三个稀释度，对于结果判断的准确性非常有帮助。结果判断如下：（1）如果三个稀释度的检测结果都为阴性，说明血清没有支原体污染；（2）三个稀释度的检测结果只要一个为阳性，说明血清有支原体污染，而且极有可能是污染了活支原体。最常见的结果是三个稀释度都为阳性或三个稀释度都为阴性。
6.本公司同时提供经测试对各种支原体均有良好繁殖能力的支原体液体培养基（干粉型）产品。大家购买后，自己按说明书配成支原体液体培养基，其中的马血清可以不加，而用待测的胎牛血清代替（终浓度10%即可）。其中的青霉素可以不用添加或者用细胞培养用的青霉素和链霉素（100×，按1:100加入）代替。1瓶支原体液体培养基（干粉型）大约可以检测1000个血清样品。
7.如果大家觉得上述检测非常繁琐，本公司同时供应经上述步骤严格检测，证明100%不含活支原体的精选进口胎牛血清。
其他：如何检测胰酶、抗生素、未使用的动物细胞培养液等细胞培养相关试剂是否含有支原体污染？
这些样品也不适合直接检测。方法与血清的检测方法非常类似，在对其进行检测之前，也必须将其中可能含有的支原体进行大量的繁殖。首选，必须先检测支原体液体培养基中含有的血清是否被支原体污染，在保证血清没有支原体污染的前提下，配制含10%经证明没有支原体污染的血清的支原体液体培养基，然后将不少于1 mL的胰酶、抗生素或者动物细胞培养液等按1:10稀释到该培养基中，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培养箱或者普通的细菌培养箱中培养3天，3天后的进行支原体的检测，方法同上。
运输和储存
该产品在常温下运输和保存，保存期3年。注意：本产品极易吸潮，请密闭储存于阴凉干燥环境。开封后，也请将瓶子放入自封袋内密闭储存。
产品用途
用于支原体（Mycoplasma）的培养。该产品仅用于基础研究，非临床用品。
支原体简介
支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜，造成细胞的支原体污染。
细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等；
哺乳动物细胞的培养，支原体污染是个世界性的问题。目前，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%，有些国家甚至高达80-90%。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误（支原体污染对细胞的详细危害，请参考本公司的网站：
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测，以保证所用的细胞没有支原体污染。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达107-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。而且，轻度到中度的支原体污染通常不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。
成分（每升）
酵母浸粉： 5克
牛肉浸粉：5克
猪胃消化物：10克
氯化钠：2.5克
葡萄糖：5克
酚红：0.02克
pH 7.7
使用方法
称取本产品的干粉27.52克，溶解于800毫升的蒸馏水（如有必要，可以适当加热助溶），115℃高压蒸汽灭菌15分钟。无菌操作加入马血清200毫升、青霉素80万单位，混匀后，4 ℃储存备用。
注意事项
当本产品用于检测细胞培养用的牛血清、胰酶、抗生素或培养液中是否含有支原体污染时：（1）马血清可以用牛血清代替；（2）青霉素80万单位可以不用添加或者用细胞培养用的青霉素和链霉素（100×，按1:100加入）代替。
《动物细胞或组织基因组DNA提取试剂盒》（无苯酚和氯仿）
运输和储存
该产品在常温下运输和保存，保存期1年。
产品用途
该产品可用于提取动物细胞或组织的基因组DNA，提取的基因组DNA可用于常规的PCR扩增、Southern杂交、文库构建等应用。
产品优点
1. 整个基因组DNA的提取过程，无需使用有毒的苯酚和氯仿。
2. 由于基因组DNA的提取过程不需要使用离心吸附柱，提取的基因组DNA片段较大，非常适合用于长片段PCR的扩增、Southern杂交、文库构建等应用。
试剂盒组成
1. 细胞裂解液：50 mL
2. 蛋白沉淀液：10 mL
? 注意：以下试剂需要自己准备：（1）20 mg/mL蛋白酶K（溶于水，-20 ℃保存）；（2）异丙醇；（3）75% 乙醇；（4）TE 溶液（1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。
提取步骤：
1. 细胞或组织的裂解和消化：
（1） 细胞：取100-1000万个细胞（如果是贴壁细胞，请先用胰酶消化）在1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上，1500 rpm（约200 g），离心5 分钟。弃上清，往细胞沉淀中加入500μL细胞裂解液，再加入 5μL蛋白酶K（20 mg/mL），用1 mL的吸头将细胞沉淀缓慢吹散，50 ℃消化3小时。
（2） 组织：取哺乳动物组织大约20-50 mg（比如，可以是1-2个小鼠的脚趾或3-5 mm的鼠尾），用剪刀将组织尽量剪碎，加入500μL细胞裂解液，再加入 5μL（20 mg/mL），50 ℃消化过夜，至组织被消化完全为止。
注意A：上述细胞或者组织在50 ℃消化期间，如果有条件，最好能放在摇床上不停震荡。如果不能，请每隔一段时间，上下颠倒离心管8-10次，以帮助消化。
注意B：在处理组织的过程中，请勿交叉污染。在处理完一个组织样品后，用含有75% 乙醇的棉球擦拭剪刀，并在火上烧灼后，再处理下一个组织样品。
注意C：如果组织经蛋白酶K消化过夜，仍然未消化完全，可以再加入适量的蛋白酶K，继续消化，至组织被消化完全为止。
2. 消化完毕后，将含有细胞或组织裂解液的离心管放室温，加入100 μL的蛋白沉淀液，盖上盖子，上下颠倒离心管8-10次，冰浴10 min。
3. 将离心管放入普通台式离心机上，13000 rpm，离心5 分钟，上清移至新的离心管，弃沉淀。
注意：吸取上清时，勿接触到底层的蛋白质沉淀。
4. 加入等体积的异丙醇，室温放置5 min，13000 rpm，离心5 分钟，弃上清，此时，管底可见白色DNA沉淀。
5. 加入1 mL 75% 乙醇溶液，上下颠倒离心管以洗涤沉淀，13000 rpm，离心5 分钟，用1 mL吸头将上清吸走并丢弃。
注意：勿将沉淀吸走。
6. 再次13000 rpm，离心30秒，用200 μL吸头，将管底的剩余液体吸干净并丢弃。
7. 将含DNA沉淀的离心管放入50°C烘箱中干燥10 分钟，干燥后沉淀呈透明状。
注意：此步骤的目的是让乙醇彻底挥发干净。
8. 用100 μL TE溶解DNA沉淀，放入50°C水浴加热30 分钟，以帮助基因组DNA的溶解（如有必要，可以用剪去尖端的200 μL吸头缓慢吹吸DNA溶液，以进一步帮助基因组DNA的溶解）。
9. 将提取好的基因组DNA放-20 ℃保存备用。至此，提取的细胞或组织的基因组DNA可用于后续的相关实验。
西域优选现货
