高效液相色谱仪原理与用途

　　试验室中用到的测试仪很多，高效液相色谱仪就是其中的一种，该仪器是在高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送。下面小编就为大家分享一下高效液相色谱仪原理与用途、特点与故障原因及处理的知识。

　　高效液相色谱仪的工作原理及用途

　　储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

　　1.环境分析中的应用：可应用于环芳烃、农药残留分析等。

　　2.食品分析中的应用：可应用于食品营养成分分析、食品添加剂分析、食品污染物分析等。

　　3.生命科学中的应用：可在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学及生化领域的分子量物质纯化、分离和测定等。

　　4.医学检验中的应用：体液中代谢物测定、药代动力学研究、临床药物监测等的分析测定。

　　5.无机分析中的应用：阴、阳离子的分析等。

　　高效液相色谱仪常见故障处理

　　故障1：流动相内有气泡，关闭泵，打开排空阀，按PURGE键清洗脱气，气泡不断的从过滤器冒出，进入流动相，无论打开PURGE键几次，都无法清除不断产生的气泡。

　　原因：

　　过滤器长期沉浸于水液内，过滤头内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅的通过过滤头，空气在泵的压力下经过过滤器进入流动相.处理过滤头浸泡在5%的硝酸溶液内，超声清洗十五分钟即可；亦可将过滤头浸泡在5%的硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开排空阀，打开PURGE键清洗脱气如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡在5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团以被硝酸破坏,流动相可以流畅的通过过滤器，打开排空阀，打开泵流速调治1.0～3.0mL/min，纯水冲洗过滤器1小时左右，即，可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。

　　故障2：柱压高；

　　原因：

　　(1)缓冲液盐份如，乙酸铵等，沉积柱内；

　　(2)样品污染沉积：

　　处理对于第一种情况先用40～50度的纯水，低速正向冲洗柱子待柱压逐渐下降后，相应的提高流速冲洗柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟，对于第2种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇[4+6]冲洗柱子[冲洗时间的长短由样品的污染情况而定]，在用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗，正向冲洗柱子30分钟以上。

　　故障3：既无压力指示又无液体流过

　　原因：

　　1.泵密封垫圈磨损；

　　2.大量气体进入泵体：

　　处理对于第一种情况,更换密封垫圈，对于第二种情况,在泵作用的同时，用一个50mL的玻璃针筒在泵的出口处不帮助抽出空气。

　　故障4：压力波动大，流量不稳定。

　　原因：

　　系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间家有异物，使得两者不能密封；

　　处理：工作中注意流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气，如，为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。

　　故障5：出峰不准，峰分叉。

　　原因：

　　(1)色谱柱被污染；

　　(2)柱头填料塌陷：

　　处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后，再用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上，如，冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷，去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与助内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。

　　故障6：峰面积重复性不佳。

　　原因：

　　（1）进样阀漏夜；

　　（2）加样针不到位：

　　处理：

　　对于第一种情况更换进样垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速，平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常生活中，液相色谱仪的保养非常重要，如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲溶液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱住的使用寿命，同时，避免注射过量浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱住作好标记，用于不同分析目的的色谱住不要混用等。

　　上文的知识就是小编为大家分享的高效液相色谱仪原理与用途、特点与故障原因及处理方法，希望大家可以有所收获。高效液相色谱仪在使用的过程中会出现很多的问题，如果操作者可以了解故障的原因，就可以很好的去预防和排除这些故障，并且可以为正确使用该仪器使其发挥出最大的性能。

　　高效液相色谱法(gāo xiào yè xiàng sè pǔ fǎ)的定义

　　高效液相色谱法是指具有高分离效能的柱液相色谱法。

　　高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

　　对仪器的一般要求和色谱条件

　　高效液相色谱法所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

　　色谱柱

　　反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间，粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。

　　使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。

　　以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。

　　流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机－无机杂化填充剂等。

　　检测器

　　最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

　　紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。

　　紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。

　　不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（2010年版药典二部附录ⅣA）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。

　　流动相

　　反相色谱系统的流动相首选甲醇－水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈－水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

　　各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。

　　对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。

　　高效液相色谱仪介绍

　　高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

　　高效液相色谱仪发展历史

　　1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

　　1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC）正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

　　1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。

　　高效液相色谱仪应用

　　高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。

　　与试样预处理技术相配合，HPLC 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。

　　HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。

　　液相色谱- 质谱联用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等； 液相色谱- 红外光谱联用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。

　　高效液相色谱仪操作步骤：

　　1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

　　2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

　　3）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，链接监测系统。

　　4）进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

　　5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min

　　6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000.点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

　　7）设计走样方法。点击file。选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击 new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟； b.基线归零； c.进样阀的loading-inject转换； d.走样时间，随不同样品而不同。

　　8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

　　9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。

　　10）填写登记本，由负责人签字。

　　注意事项：

　　1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

　　2）柱子是非常脆弱的，*次做的方法，先不要让液体过柱子。

　　3）所有过柱子的液体均需严格地过滤。

　　4）压力不能太大，zui好不要超过2000psi

　　1.使用“保护柱”，能够延长色谱柱的使用寿命。简单的说，“保护柱”即是很短的色谱柱，填装和所使用液相色谱柱相同的填料。正确使用装在液相色谱柱前面的“保护柱”，可以阻拦一些容易损坏液相色谱柱的物质。而达到延长柱子寿命的效果。如果使用“保护柱”不当会造成反效果。因为都在保护柱使用过程中。如污染达到一定程度而没有及时更换，累积的杂物很可能会冲入色谱柱中，反而会造成色谱柱损坏。因此。使用“保护柱”时，zui重要的是要知道什么时候该保护柱。该换的时候就必须要立即更换。

　　2.选择高品质的柱子，并注意使用方法；可以延长柱子的使用寿命。一般认为同一厂牌、同一型号的柱子之间的品质都相同，对品质管理很严格的厂家而言，这种说法是成立的。但如果厂家质管理不够严格，即使是同一批号的新柱子之间的品质也有差异。所以，选用柱子时必须选择管理严格的高品质柱子，我们知道，任何柱子使用过后都会产生变化。尤其如在强酸或强碱条件下使用，柱子更易产生变化。因此，尽量选用pH适用范围大的柱子。在开发信分析方法时，许多专家建议不要使用旧柱子。因柱子一经使用。柱性会改变；如此一来，使用旧柱子开发出来的新分析方法，很可能在使用同厂牌的新柱子分析时。发生无法达到预定效果的情况。总的说。开发新分析方法时使用品质好的新主子；并且一直柱子zui好使用在一种分析方法上；则柱子寿命可以延长。

　　3.定期冲洗柱子可以延长柱子使用寿命。我们知道柱子使用一段时间后总会有一些杂质累积在柱内。这些杂质不会随着流动相出来，自然会逐渐影响柱子的品质。这些杂质在后来的分析谱图上出现。而造成出现怪峰、基线不平等现象。简单的解决方法是用较强的流动相冲洗。zui好是在每次分析某一产品完成后冲洗。如果分析时使用缓冲剂时，zui好用水来取代缓冲剂。先使用有机和水的混合溶液为流动冲洗缓冲剂。接着再用100%有机溶剂冲洗。如果不先用有机和水的混合溶液冲洗，而直接用100%有机溶剂冲洗的话，缓冲剂很可能会沉淀出来，而损坏柱子的品质。使用10-20倍柱体积的量来冲洗基本就足够了。专家建议zui好将100%有机溶剂冲洗的条件加在分析实验程序完毕的zui后，如此一来每天在开机前都会用100%有机溶剂冲洗。一般硅胶柱可以反冲洗处理，即是在将冲洗前将柱子倒反接后再冲洗。打算使用反冲洗处理前，zui好先参考柱子的保养说明书。所以要真正保护柱子，使用柱子的寿命延长，zui好是使用“保护柱”和定期冲洗柱子。

　　液相色谱使用及注意事项

　　(注：使用 HPLC 前请充分理解本 protocol， 首次使用请在熟悉 HPLC 的人员指导下进行)

　　一：高效液相色谱仪（HPLC）的组成和各个部件的功能简介:

　　HPLC 由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、信号采集等五大部分组成。分析前，检查是否是合适的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用液相专用微量平头进样器进样，流动相把样品带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，信号采集输出至电脑经过处理形成色谱图。色谱图是定性、定量

　　和评价柱效高低的依据。

　　高压输液系统：高压输液泵是 HPLC 关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续稳定送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。进样系统：包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入

　　色谱柱中进行分离。

　　分离系统：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，其内径为 2 ~ 6mm，柱长为 10 ~50cm，我们柱温箱可以使用小于 300 mm色谱柱，内部充满微粒固定相，柱温根据文献设定。

　　检测系统：荧光检测器和紫外检测器

　　荧光检测器 (Fluorescence Detector,简称 FLD) 是 HPLC 常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。选择性高，只对荧

　　光物质有响应;灵敏度也高，适合于多环芳烃（PAHs）及各种荧光物质的痕量分析。每种物质对应特定的激发波长和发射波长，根据参考文献进行所测样品的两

　　个波长设置。

　　紫外检测器（Ultraviolet Detector）是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，其工作原理是 Lambert-Beer 定律，即当一束单色光透过流动池时，若流动相不吸收光，则吸收度 A 与吸光组分的浓度 C 和流动池的光径长度 L 成正比。物理上测得物质的透光率，然后取负对数得到吸收度。大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外或可见光吸收基团，因而有较强的紫外或可见光吸收能力，因此 UVD 既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围，是液相色谱中应用最广泛的检测器。每种物质对应特定的吸收波长，根据参考文献进行所测样品的两个

　　波长设置。

　　信号采集：液相色谱工作站对检测器信号进行采集，集成处理数据，形成色谱图。

　　二：操作规程-方法建立-数据处理

　　操作过程：

　　在开机之前，根据所做样品的方法要求，准备好所用流动相，标样及样品。流动相0.22μm膜抽滤后超声脱气30分钟。A、B两相中，则A管道连接蓝盖瓶的水相，B管道连接蓝盖瓶的有机相。确保每天用重新超声和超滤过的水和有机相。所有样品过膜（0.22或0.45μm滤膜）后使用。

　　开机步骤：

　　依次打开电脑→泵→柱温箱→检测器→打开LC solution→点击“1分析”听见“滴滴”两声待自检通过→打开“文件”中“方法文件夹”调出方法，平衡压力30分钟左右即可进样。

　　进样步骤：

　　打开左栏框内“单次运行”→载入“方法文件”和“数据文件”后点击“确定”→进样阀上扳、进样打针、下扳、取针，自动开始走样。

　　关机步骤：

　　试验结束后用水相（有盐离子时必须用水冲洗干净时间最少1小时）或有机溶剂冲洗管道（半小时以上），冲洗结束后分两种情况：

　　1，第二天继续做样：流速调小约0.1ml/min（确保AB两相不能走空，蓝盖瓶内溶液足够）→关闭检测器光源→关闭柱温箱（第二天做实验依次打开柱温箱和检测

　　器光源）

　　2，长期不用：根据色谱柱保存要求进行封柱（如PAHs专用柱：用100%乙睛1.0 ml/min冲洗1个小时左右）→关掉检测器光源→关掉仪器→关软件（“滴”一声）→关泵→关电脑。

　　方法建立：

　　建立色谱操作方法：

　　建立色谱操作方法（参数设置：流动相 AB 比例，流速，柱温箱，波长的设置）。注意保存为自己命名的 Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；标准曲线的建立：

　　配置一系列标准浓度梯度的标液，一般采取逐级稀释的方法（5-8 个点）。具体步骤参照仪器使用说明 P18-P24 页。

　　数据处理：

　　“再解析”里读取最终浓度，誊抄到自己的记录本上。

　　三：HPLC 操作注意事项

　　1, 排气泡

　　如何排出 Teflon 管道内气泡：

　　排空操作：打开LC-20AT泵排空阀（逆时针90度以上），按Purge键，泵开始排

　　空运行。检查流动相入口Teflon管路没有气泡后，Purge灯不再闪烁时，关闭LC-20AT泵排空阀。

　　如何排出进样针内气泡：

　　使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用多次清洗进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液润洗进样针筒 3 遍以上，并排除针筒中的气泡（进样针吸取样品之后，颠倒针管，气泡会往上跑，猛推一些样品出去，气泡即可随之排出）。

　　2 流动相：

　　流动相应选用色谱纯试剂、高纯水，酸碱液及缓冲液需经 0.22μm 膜过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和有机相膜的使用范围； 使用泵时，A、B 两相中，则 A管道连接蓝盖瓶的水相，B 管道连接蓝盖瓶的有机相。确保每天用重新超声和超滤过的水和有机相。

　　3 色谱柱：

　　使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如 pH 值、流动相类型等；

　　使用符合要求的流动相；

　　使用保护柱；

　　如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5%甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

　　色谱柱在不使用时，根据柱子特性和使用要求，用不同溶剂封存。比如，PAH专用柱用乙腈冲洗封柱，取下后紧密封闭两端保存；不要高压冲洗柱子；一般用流速 1.0ml/min 冲洗，压力约 7Mpa。

　　4 样品：

　　进样之前必须用 0.22μm 滤膜过滤，确保样品中不含固体颗粒；

　　一般尽量用流动相制备样品液。比如测 PAHs 时，流动相用的是水和已腈，进样的溶剂也应为水或已腈。

　　手动进样时，进样量一般大于 40μl，并且不要含气泡，针头外壁要擦净。

　　5 压力

　　操作过程若发现压力很小，（一般是在 6-20）则可能管件连接有漏，注意检查。当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击On line操作界面中的Instrument/System Off，然后再点击操作界面中的 Instrument/System On 即可。

　　操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；

　　6 切记关灯

　　超过 2 小时以上不做实验时，从工作站将检测器灯关掉（灯的寿命有限）。

　　7 使用登记：

　　使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时报告，不要擅自拆卸仪器。

　　液相色谱根据分离机理的不同可分为：

　　液固吸附色谱

　　液液分配色谱

　　离子交换色谱

　　离子对色谱法

　　分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)

　　（一）液-固吸附色谱

　　流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。

　　（二）液-液分配色谱

　　流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。

　　流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法。

　　流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法。

　　（三）离子交换色谱

　　（四）离子对色谱法

　　（五）分子排阻色谱法

　　气相色谱法(GC)与液相色谱法(LC)分类

　　按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法

　　(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)

　　和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数

　　大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

　　按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲

　　和色谱法，此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。

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