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  • 高效液相色谱仪分析技术在生命科学领域的应用

    文/ 发布于2018-12-25 浏览次数:994

      高效液相色谱分析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)又称高压色谱分析,是21世纪70年代急剧发展起来的一项高效、新颖、快速的分析分离技术。由于分离机制的不同,可分为以下几种类型:液固色谱、液液色谱、离子交换色谱、离子对色谱、亲和色谱、电色谱等。其中,反相色谱的应用较多,占高效液相色谱的70%~80%。高效液相色谱具有以下突出的特点:1.高压:高效液相色谱以液体作为流动相,这种液体称为载体。由于载液流经色谱柱时,受到阻力较大,为了使载液迅速通过色谱柱,必须对载液施加高压,压力一般达1.52×10-4~3.04×10-4kPa。

      2.高速:高效液相色谱由于采用了高压,载液流速快,因而所需的分析时间较之经典液体色谱法少得多。

      3.高效:高效液相色谱法的柱效很高,约可达3万塔板/m以上。

      4.高灵敏度:由于采用高灵敏度的检测器,最小检测量可达10-9g,而所需试样量较少。

      一、高效液相色谱分析原理

      高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程,他借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

      要提高分离度, 共有三条途径:

      (1)在其他条件相同的情况下,增加n可以使色谱峰变狭。这点可改通过增加柱来实现。但增加柱长分离时间也会增加, 但如果采用高效能的填充剂,不仅可提高分离度,而且能使广峰形变狭而提高检出的灵敏度。

      (2)使后一组分相对于前一组分的保留时间增加来提高分离度。这可通过改变移动相或固定相的组成来达到。最有效的方法就是改变移动相的极性这就是高效液相色谱中通常采用连续改变移动相极性的梯度淋洗法。

      (3对液相色谱来讲,移动相极性增高,k见笑,色谱峰向前移,分离度降低;移动相极性减小,k增加,色谱峰的流出时间增加,同时峰形变宽,分离度提高。但若k过大,不但分离时间拖得很长,而且峰形变平坦,影响分辨率和检出灵敏度,k的有效范围以a

      二、高效液相色谱在生命科学中的应用

      高效液相色谱作为一种十分重要的分离分析技术,自70年代初崛起以来,一直受到生命科学界广大研究人员的高度重视,液相色谱仪用于一系列生命科学前沿领域中的重大课题,并在其中发挥了特殊作用,它在包括生物大分子在内的生物活性物质的分离分析,以及制备纯化方面得到了越来越广泛的应用,特别是它的制备纯化能力是其它方法无法取代的。

      1、氨基酸

      氮基酸是构成生物大分子,多肤和蛋白质的基本结构单元,在生命现象中起着重要作用。传统的氨基酸专用分析仪就是采用离子交换色谱和柱后衍生技术研制成功的,近年来采用反相HPLC和柱前衍生技术分离分析氨基酸已成为快速, 高灵敏度和高再现性的方法,可准确测定样品中各种氨基酸,尤其是带侧链的氨基酸, 疏水氨基酸,特殊氨基酸如鸟氦酸6 以及磷酸化氨基酸的含量。柱前行生法的关键在于衍生试剂的选择。美国Waters公司专为氨基酸分析合成了专利衍生试剂—AQC,提供一个简便易行,灵敏准确的氨基酸分析方法。

      2、肽和蛋白质

      肤和蛋白质都是由氨基酸残基通过肽键按一定的顺序连接起来的生物大分子,它们之间没有严格的区别,一些研究者习惯以50个氨基酸残基为界限,分子中所含氨基酸残基数少于50的称为肽或者多肽,而高于50的称为蛋白质。目前HPLC技术已成为分离纯化及鉴定肽和蛋白质的不可缺少的工具,分离纯化肽和蛋白质的HPLC模式主要有四种:(1)凝胶色谱是按肽和蛋白质分子大小进行分离;(2)离子交换是按肽和蛋白质分子所具有的带电基团性质和数目进行分离;(3)反相色谱是按肽和蛋白质分子的疏水性强弱进行分离;(4)亲和色谱是根据肽和蛋白质的生物专一性进行分离。选择何种HPLC模式分离纯化肽和蛋白质主要取决于待分离肽和蛋白质的来源,要求达到的纯度和数量。

      近年来人们将非线性色谱理论用在蛋白质的分离和纯化中,为大规模分离纯化蛋白质打下理论基础,也使得基因工程生产蛋白质药物进行大规模的分离纯化,实现产业化成为可能。

      3、糖类

      糖类化合物是指多轻基的醛、酮、醇和它们的氧化还原产物,以及由糖苷键连接此类化合物而成的多聚体,可分为单糖及其衍生物,寡糖、多糖和复合多糖。HPLC是分离分析各种糖类的有效工具。单糖、双糖及寡糖的分离分析常用氨基键合柱和乙晴/水流动相。如用C18硅胶柱,流动相中要加入多胺改性剂。阳离子交换色谱分离糖类分析时间短、准确、色谱柱有较好的耐受性并易再生目前用于糖类分析的阴离子交换剂主要有:季胺硼酸型阴离子交换树脂,硅胶化学键合阴离子交换剂以及近年来发展起来的表面薄壳型阴离子交换树脂。多糖的分子量可用凝胶色谱测定。

      糖类化合物没有紫外吸收,故一般只用示差折光检测,为提高检测灵敏度可用柱后或柱前衍生。

      4、维生素

      维生素类含量测定早期多采用生物法,这种方法灵敏度高,但精密度差,耗时长,局限性大,目前已经很少采用。比色法,分光光度法和荧光法干扰严重,GC分析维生素物质有很多有点,已获得许多应用,但不适合对热不稳定的维生素A和D。HPLC分析维生素物质不需要高温,样品纯化步骤少,所费时间短,灵敏度高,重现性好,越来越得到广泛应用。

      脂溶性维生素A、D、E、K以及它们的同系物,衍生物和有关化合物,过去常用正相HPLC分离分析,固定相多选用硅胶柱、NH2基柱或CN基柱,流动相选用非极性或极性较弱的容积,检测多用紫外检测器。但近年来随着HPLC发展,采用C18、C8柱的反相HPLC分离分析脂溶性维生素的越来越多。水溶性维生素的分析中反相HPLC,离子交换和离子对色谱占主导地位,同时更多地使用电化学检测器。

      5、核酸

      核酸是脱氧核糖核酸和核糖核酸两类物质的总称,是由103~109个核苷酸通过磷酸二脂键形成的一类存在于一切生命体中的大分子物质,是基因的物质基础。核酸研究的基本方法离不开抽提、分离、纯化和测定,而实践证明HPLC可以分离、提纯各种核酸及其组分,进行定性或定量分析,并结合生化法、酶法和电泳法分析核酸片段,聚核苷酸的核苷酸顺序,方法简便、可靠、准确。采用的方法主要是离子交换色谱,反相色谱和反相离子对色谱。

      6、生物碱

      在生命体内通常把除了氨基酸、多肽、蛋白质以外的带有氨基基团的生物活性物质称为生物胺。常见的有乙胺、胆胺、组织胺、胆碱,乙酞胆碱等。最受学术界关注的是多胺类、儿茶酚胺类和5—羟色胺类物质。生物胺检侧在生命科学中有重要价值。近20年来曾试用过多种分离分析方法,如生化法、纸层析、薄层层析、气相色谱、放免法、放射酶法和HPLC法。实践证明就分离和最低检测限而言,放射酶法和HPLC法比较理想,但前者仪器和技术要求较高,价格昂贵,目前学术界属意于HPLC法作为常规检查工具。常用的分离模式有离子交换色谱,反相HPLC和反相离子对色谱检测方法。主要是荧光检测,一般是用荧光衍生后再用荧光检测器检测,用电化学检测器也可提高检测灵敏度,但多胺也需进行衍生,儿茶酚胺类则无需衍生。

      三、结语

      高效液相色谱是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域,世界上几百万种化合物中80%的化合物,包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定型化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC进行分离分析, 而现在通过与GC—MC联用,与核磁共振、高光敏度检测、电感偶合等离子体质谱、固相微萃取联用,使HPLC成为在药物研究所、检测所、药厂和临床检测中的主要分离分析工具。今后,随着各种分析分离技术的出现及联用技术的发展,HPLC将会在生命科学领域应用更加广泛。

      

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