操作气相色谱仪如何选用不同气体纯度的气源

　　操作气相色谱仪如何选用不同气体纯度的气源做载气和辅助气体，虽然是一个老的技术问题，但是对于刚刚接触气相色谱仪的用户，目前很难找到有关这方面的综合资料，所以他们总是到处询问究竟选择什么样的气体纯度最好的这类问题。根据每一家用户具体使用的那一类仪器，选择什么样纯度的气体，确实是一个比较复杂的问题。原则上讲，选择气体纯度时，主要取决于① 分析对象；②色谱柱中填充物；③检测器。我们建议在满足分析要求的前提下，尽可能选用纯度较高的气体。这样不但会提高仪器的高灵敏度，而且会延长色谱柱，整台仪器的寿命。

　　实践证明，作为中高档仪器，长期使用较低纯度的气体气源，一旦要求分析低浓度的样品时，要想恢复仪器的高灵敏度有时十分困难。对于低档仪器，作常量或半微量分析，选用高纯度的气体，不但增加了运行成本，有时还增加了气路的复杂性，更容易出现漏气或其他的问题而影响仪器的正常操作。另外，为了某些特殊的分析目的要求特意在载气中加入某些“不纯物”，如：分析极性化合物添加适量的水蒸气，操作火焰光度检测器时，为了提高分析硫化物的灵敏度，而添加微量硫。操作氦离子化检测器要氖的含量必须在5~25ppm，否则会在分析氢，氮和氩气时产生负峰或“W”形峰等。本文就不在此做详细讨论了。

　　气体纯度低的不良影响

　　根据分析对象，气相色谱柱的类型，操作仪器的挡次和具体检测器，若使用不合要求的低纯度气体，不良影响有以下几种可能：

　　1）

　　样品失真或消失：如H2O气使氯硅样品水解；

　　2） 色谱柱失效：H2O，CO2使分子筛柱失去活性，H2O气使聚脂类固定液分解，O2使PEG断链。

　　3））

　　有某些气体杂质和固定液相互作用而产生假峰；

　　4） 对柱保留特性的影响：如：H2O对聚乙二醇等亲水性固定液的保留指数会有所增加，载气中氧含量过高时，无论是极性或是非极性固定液柱的保留特性，都会产生变化，使用时间越长影响越大

　　5） ）

　　检：

　　TCD：信噪比减小，无法调零，线性变窄，文献中的校正因子不能使用，氧含量过大，使元件在高温时加速老化，减少寿命。

　　FID：特别是在Dt≤1Ⅹ10ˉ⒒/秒下操做时，CH4等有机杂质，会使基流激增，噪声加大不能进行微量分析。

　　ECD：载气中的氧和水对检测器的正常工作影响最大，在不同的供电工作方式中，脉冲供电比直流电压供电影响大，固定基流脉冲调制式供电比脉冲供电影响大。这就是为什么目前诸多在操作固定基流脉冲调制式ECD时，在载气纯度低时必须把载气纯度选择开关从“标准氮”拨到“一般氮”位置的原因。大家会发现在此情况下操作，不但灵敏度变低，而且线性亦变窄了。实践证明：在操作ECD时，载气中的水含量低于0.02ppm,氧低于1ppm时可达到较理想的性能。值得指出的是,我们多次发现由于仪器的调节气路系统被污染而造成的对载气的二次污染至使ECD基频大幅度增加使信燥比减小。FPD和NPD等常用检测器,由于他们属于选择性检测器,操做时要根据分析要求,特别注意被测敏感物质中杂质的去除。

　　6）在做程序升温操作时,载气中的某些杂质,在低温时保留在色谱柱中,当拄温升高时不但引起基线漂移还可能在谱图上出现比较宽的"假峰"。

　　7）仪器影响

　　a. 各类过滤器加速失效;

　　b. 调节阀（稳压阀,稳流阀,针形阀）被污染,气阻堵塞,调节精度降低或失灵；

　　c.气路系统被污染,若要恢复仪器在高灵敏度情况下操做,有时要吹洗很长时间（可能一周以上）污染严重时有时再也无法恢复。

　　d.检测器的寿命,实践表明,对ECD和TCD的寿命影响最明显，应引起用户特别注意

　　激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量分析相比，具有以下优点：

　　1．更精细、精确度更高。激光扫描共聚焦显微镜对免疫荧光组织化学染色样品做定量分析时，利用激光聚焦和系统软件分析对组织进行深层扫描，不破坏组织细胞结构，可深层次准确定位并精确定量。而一般图像分析只是以荧光灰度的差别变化进行半定量分析。

　　2．激光扫描共聚焦显微镜一般有两个以上不同波长的激光管，只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析两种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，精确而又方便，这一特点是一般图像分析无法比拟的。

　　3．激光扫描共聚焦显微镜可根据需要提供纯荧光、白光以及荧光与白光合成图像等多种图像，远远优于一般图像分析。

　　4．以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，用石蜡切片在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强影响观察结果。而石蜡标本来源广泛，适用于回顾性研究。激光扫描共聚焦显微镜可扫描石蜡切片的荧光染色，可避免因背景非特异性荧光过强而影响观察结果，从而可获得清晰图像，这也是激光扫描共聚焦显微镜的优势所在。

　　激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项

　　一、制备高特异性和高效价的荧光抗体

　　标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和高效价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与高效价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。

　　二、标本制作要求

　　1．标本厚度

　　组或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在标本下部，而物镜观察的上部不能被充分激发。

　　2．载玻片

　　载洁，无自发荧光；载玻片厚度应在0．8～1．2mm之间，太厚会吸收较多的光，不能使激发光在标本上聚焦。

　　3．封固剂

　　甘透明，无自发荧光。由于荧光在pH 8．5～9．5时较亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。

　　三、定量研究的要求

　　1．随机性

　　(1)在感兴趣区域内随机抽样，不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”，这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。

　　(2)在随机抽取的切片上，应随机抽取观察视野。

　　(3)在随机抽取的视野中，通过连续观察“光学切片”，得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”，需要在Z轴方向随机抽样，然后作定量研究。

　　2．避免参照陷阱 如果获阱

　　如是密度信息，当比较各组参照空间(包含待测结构的区域)的体积不同时，根据密度信息可能得出错误结论。因此，需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。