等电点聚焦电泳仪：测定蛋白质等电点

　　聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点

　　一、目的：

　　学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

　　二、原理：

　　等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrofocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

　　等电点聚焦电泳产生pH梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

　　理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：

　　R1和R2为氢或带有氨基的脂肪基。这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。目前，载体两性电解质商品在使用时还存在一些问题，如样品中的盐浓度对pH梯度有影响等，但毕竟优点很多，仍然得到广泛应用。

　　分析载体两性电解质的结构可知，它既有酸性基团(—NH3+ )，也有碱性基团(—COO- )，既可接受分子，也可释放质子：

　　它们在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷。当它们所带的正负电荷相等时，其净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH值为该两性电解质的等电点，以pI表示。所以两性电解质的等电点在数值上等于它呈电中性时溶液的pH值。等电点是反映两性电解质在溶液中得失质子的能力，是它的物化性质。两性电解质在溶液中的行为可以从两方面看，一方面溶液的pH决定它带电荷的性质。如溶液是pH7，对pI=9的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pI的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：

　　使溶液pH有所改变。当某一两性电解质pI较低，即释放质子（H+）能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变。

　　载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分布在2.5—10之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。由于凝胶的防对流扩散作用，使pH梯度保持稳定不变。实验操作中，要求开始电泳时恒压60V，15min，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pH梯度。此后，恒流为8mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐渐泳动到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。当电压升到550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到580V，继续电泳120min后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。蛋白质样品也因其等电点的差异而得到集中和彼此分开。

　　最早的等电聚焦电泳是垂直板式，后来发展为水平板式。超薄层水平板式也是近几年发展起来的，这种形式的电泳的优点是节省两性电解质试剂、加样数量多、利于比较不同样品的电泳结果，而且电泳后的固定、染色和干燥都很方便、迅速。水平板式等电聚焦电泳的最大优点是防止了由于电极液的电渗作用而引起pH梯度的漂变。

　　三、器材及试剂：

　　1．器材：

　　稳流稳压电源，水冷式平板等电聚焦电泳电槽，玻璃板（11.5×11.5×0.2cm），大铁文具夹，塑料模具（厚0.5mm，中间开孔9.0×9.0cm），小眼科剪子，镊子，解剖刀，1ml注射器，50μl和100μl微量注射器，擦镜纸，滤纸，精密pH试纸，凝血板，培养皿（120mm），脱脂棉，棕色试剂瓶，吸液管，吸耳球，玻璃纸，坐标纸。

　　2．试剂：

　　重蒸水，丙烯酰胺（重结晶），甲叉双丙烯酰胺（重结晶），过硫酸铵，TEMED（四甲基乙二胺），载体两性电解质（pH3.5—10），考马氏亮蓝R250，液体石腊，乙醇（95%），硅油，磺基水杨酸，三氯乙酸，甲醇，乙酸（36%），已知pI蛋白质样品和标准等电聚焦样品（市售），磷酸，氢氧化钠。

　　3．溶液配制：

　　（1）单体贮液：丙烯酰胺2.91g，甲叉双丙烯酰胺0.9g，重蒸水溶解，定容到100ml，过滤备用（在棕色瓶中4℃可保存两周）。

　　（2）电极液：阳极1mol·L-1磷酸（H3PO4）：原磷酸试剂的浓度约为16mol·L-1，故配制时用重蒸水稀释16倍即可。

　　阴极 1mol·L-1氢氧化钠（NaOH）：称取4g固体溶于100ml重蒸水中。

　　（3）固定液：甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水杨酸3.5g加水定容到100ml。

　　（4）染色液：乙醇35ml，冰乙酸10ml，考马氏亮蓝R2500.1g加水定容到100ml，溶解后过滤备用。

　　（5）脱色液：乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。

　　（6）保存液：甘油1—5ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。

　　（7）样品：牛血清蛋白 1mg·ml-1，糜蛋白酶元A 1mg·ml-1，肌红蛋白 1mg·ml-1，卵清蛋白 1mg·ml-1，标准等电聚焦样品。

　　（8）大鼠肌肉提取液：1g鼠肌肉，加水5ml，匀浆提取，离心取上清液透析备用。

　　（9）10%过硫酸铵：称1g溶在10ml重蒸水中（纯过硫酸铵溶解时会有响声）。

　　四、操作步骤：

　　1．凝胶配制

　　单体贮液2.0ml，重蒸水5.3ml，载体两性电解质0.6ml，真空抽气15min后加TEMED（原液）8μl和10%过硫酸铵60μl，混匀立即灌胶。

　　2．灌胶

　　（1）准备

　　● 取3mm洗净晾干的玻璃板，涂上一层薄薄的防水硅油，以重蒸水冲洗，使硅油分布均匀。

　　● 平板电泳槽调水平，电泳槽上放上一张滤纸。

　　● 滤纸上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（参看图20-3（a））。

　　● 用文具夹将模具和玻璃板固定在平板电泳槽上。

　　● 在模板上面，文具夹的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。

　　（2）灌胶：小心、迅速地将混匀的胶灌到模具的框内。灌胶时胶液沿着上面有硅油的玻璃板的一端即文具夹的另一端，向文具夹方向推进，边灌胶边推上面的玻璃板，使模具框内充满胶液，框内不能有气泡，为赶走气泡可移动玻璃板，待气泡释放后再向前进，一直推到接触文具夹，使两块玻璃把胶封在框内，模具框内充满胶液，切不可有气泡，否则要重新制胶和灌胶（参看图20-3(b)）。

　　在正式灌胶之前调水平之后，以8ml水代替胶液练习灌胶，直到不产生气泡为止。操作熟练后，洗净玻璃板、模具、晾干备用。抽气后再加TEMED和过硫酸铵，混匀后迅速灌胶。过硫酸铵溶液要新鲜，必须当天配制。

　　（3）去掉上面的玻璃板和模具：灌胶后室温静止1h，在模具和胶的边缘可观察到折光，这是胶已凝固的特征。再老化0.5h，然后小心将两块玻璃打开，凝胶和模具会自然地贴附在其中一块玻璃板上，去掉上面的模具及凝胶板周围的和渗出边缘的残胶，即可作加样准备。

　　3．加样、电泳

　　（1）加样前准备

　　● 在电泳槽上涂一层液体石腊，再铺一张方格坐标纸（点样时作定位用）。用一塑料片刮去电泳槽与坐标纸之间的气泡，并使坐标纸浸透石腊。

　　● 将带胶的玻璃板放至涂有石腊的坐标纸上面，赶走气泡。

　　● 接通冷凝水，再调一次水平。

　　● 铺电极条：将1cm宽、9cm长的3层滤纸条浸透电极液（阳极用磷酸1mol·L-1，阴极用氢氧化钠1mol·L-1）后，放在另一张滤纸上吸干面上的电极液，用镊子将电极条铺在凝胶两端，轻压电极，使电极条和胶贴紧，一定要平直，多余部分剪去，胶面上的残液用滤纸吸净。

　　（2）加样

　　● 取8层擦镜纸重叠在一起，剪成约纸5×5mm小块，浸透样品，放在离电极1cm以外的胶面上。PI6以下的样品置于负极附近，pI6以上样品位于正极附近，贴紧。微量标准样品可少几层擦镜纸或直接加样在胶面上。根据玻璃板下坐标纸所显示的格子，自由选择待测样品和标准样品放置的部位。

　　● 压好电极板，盖好盖子，接通冷凝水，再调一次水平。

　　（3）电泳

　　● 开始：恒压60V，15min后，恒流8mA，电泳时电压不断上升，直到电压升为550V时，关电源。

　　● 开盖去掉加样纸，以免纸上残留的样品在染色时干扰结果的判断。

　　● 调节电源，恒压580V，继续电泳，至电流降为零（2—3h），电泳结束，关闭电源。

　　4．检测pH梯度，固定，染色，脱色，制干板

　　（1）pH梯度的检测

　　从胶板上顺电场方向切下一条胶条，并切成0.5cm等距离的小块，顺序放入小试管内，加入0.5ml重蒸水，浸泡10min。用pH试纸或微电极测定pH值，或以表面微电极直接测定pH梯度，并绘制PH—cm图谱。也可以用已知pI蛋白样品所在位置的距离与pI值绘图。

　　（2）固定染色

　　● 将凝胶取下，放入固定液中固定4h，或过夜（换一次固定液）。

　　● 去掉固定液，用脱色液漂洗一次。

　　● 将染色液倒入培养皿内，染色30min。

　　一定注意取胶时，先用固定液淋洗一下，使胶滑润，防止破裂，用固定液冲胶入培养皿，或将胶面向下，用小钢铲将胶铲下掉入培养皿内。

　　（3）脱色，保存

　　● 将染色液倒掉，加脱色液浸泡至基本无底色。

　　● 用保存液浸泡10min后，将胶板放在浸泡过保存液的二层玻璃纸之间，赶走气泡、下面垫块玻璃板，室温下自然干燥。

　　五、结果讨论和注意事项

　　1．对两性电解质的要求

　　两性电解质是等电聚焦的关键试剂，所以对两性电解质的质和量都要特别注意。两性电解质含量2—3%较适合。能形成好的pH梯度。载体两性电解质由多乙烯胺与丙烯酸进行加成反应生成的混合物，放置时间过长会长菌，分解变质，不能使用。

　　2．制胶注意的问题

　　（1）丙烯胺最好是重结晶的。

　　（2）过硫酸铵一定要新配制的（参看SDS电泳）。

　　（3）所有水要用重蒸水。

　　（4）制胶时，玻璃板和模板必须水平放置。

　　（5）模板要平直光滑，不然灌胶时易溅漏。

　　3．对样品的要求

　　（1）样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或根本不成条带。

　　（2）加样的量要适当，电泳后蛋白质条带才能清晰规整。

　　（3）加样方法可以多样，可用样纸加样；或把样品混在凝胶里；也可把样品直接点在不同位置。

　　4．防止烧胶

　　（1）平板等电聚焦电泳的胶很薄（0.6mm），当稳流在8mA时，电压可上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。

　　（2）防止烧胶的办法：注意观察，稳流8mA，电压上升到550V时，立即关电源。用恒功率电泳仪，控制输出功率在指定范围。在一定功率范围内，改进冷却条件，使因电流产生的热量及时散去。

　　（3）如果胶被烧了，可在烧断的位置换上一条宽的电极条压过断缝或在电源电极条内侧加一电极条，以此补救。

　　5．胶板制作注意事项

　　固定液可使蛋白质变性，不再扩散，故一定要多换一次；在电泳后取胶、固定、染色直至制干板都必须仔细，防止胶被损坏。