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  • RT-PCR内参基因选择:除了β-actin还能用什么?

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:3011

      Q1:要做Real-Time PCR,而该种的β-actin未确定,我知道一般用持家基因作内参,但似乎其他基因各有缺点,有的作者用他们做内参时被SCI杂志要求用两个内参以证实,我想知道的是除了β-actin,哪个基因是SCI公认的内参基因(不用作两个内参了)?

      A1:28S和18S rRNA

      甘油醛-3-磷酸脱氢酶

      还有α-tublin,ubIQuitin,GAPDH,histone

      Q2:做相对定量real-time PCR时,本人不懂操作,将beta-actin内参设置成target了,现在跑完了,有扩增曲线图,和融解曲线,但没法导出Ct值(SDS 1.4版本的软件), 请教大虾们有没有补救办法,还是只能重新跑了?

      黑色的就是我的beta-actin内参

      A2:重新设置一下不行吗?荧光信号已经收集了。不用重跑

      Q3:最近在做RT-PCR,但始终摸不清β- actin的意义。哪位可以详细介绍一下β- actin作为内参照的意义?它与目的核酸片段的对比能说明什么问题?谢谢。

      A3:1.内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指持家基因(Housekeeping Genes),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

      2.RT-PCR比较不同条件下或者不同组织中,目的基因表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

      3. beta-actin(细胞骨架蛋白)就是这样一种管家基因,它是细胞骨架微丝的基本构成单位,在各种细胞中表达一般恒定而较少变化,所以常用作RT-PCR等的内参。比较各组目的产物与其内参的比值就是相对定量啊。

      real-time PCR实验中要求有内参作为参照,内参基因通常选择持家基因,如β-actin是较常用的内参基因,因为它在各种细胞中的表达量一般是比较恒定不变的,因此是作为内参基因的首选。

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