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  • RT-PCR技术概述

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:1104

      RT-PCR简介

      RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。使用天为时代公司的总RNA提取系统(如目录号 DP405和DP406),所获得的RNA的纯度高,基因组DNA污染少,用于RT-PCR系统可得到满意结果。

      用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。

      RT-PCR引物的选择

      随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

      Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。

      基因特异性引物 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。

      RT-PCR影响因素

      RT-PCR反应受多个因素影响,如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度,扩增的循环数等。

      ◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。

      ◇对于具有较高Tm的引物,增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合,因而提高特异产物的得率。

      ◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少,或者只有很少的起始材料,有必要增加扩增的次数到45-50次。


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