RT-PCR操作步骤与方法

　　RT-PCR操作步骤与方法

　　1、转移1 pg~100 ng的poly(A)+RNA或者10 pg~1

　　μg的总RNA到一只新的离心管。用水调整体积到10 μl；将RNA样品在75℃变性5 min，将离心管迅速插入冰中冷却。

　　2、将含有这种变性的RNA样品的离心管内依次加入如下试剂：10×扩增缓冲液2

　　μl，20 mmol/L 4种dNTP混合液（pH8.0）1 μl，引物（最优）1 μl，约20单位/μl 胎盘RNase抑制剂1

　　μl，50 mmol/L MgCl2 1 μl，100~200单位/μl反转录酶1 μl，H2O补足到20μl。温育在37℃反应60

　　min。MgCl2为反转录酶所必需。

　　注意：引物与模板的最佳比例对于每一批制备的RNA样品是应该通过预实验来确定的，推荐在20

　　μl反应体系加入如下范围的引物量来筛选：与靶RNA互补的寡核苷酸5~20 pmol/L，oligo (dT)12~18 0.1~0.5

　　μg，随机六核苷酸1~5 μg。cDNA合成通过测定放射性物质的掺入量比例来确定，因为反应在反转录反应中加入了含[32P]

　　dCTP（10~20 μCi）的放射性底物（放射性比活度为3000

　　Ci/mmol）。第一链cDNA分子大小能通过碱性琼脂糖凝胶电泳来鉴定。

　　设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管中加入除了反转录酶外的所有试剂；第3支对照管加入除了引物外的所有试剂。在这些照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证反转录酶产物不是由于污杂或RNA的自身引导所致。

　　尽可能设置阴性对照管。阴性对照管用外源参考RNA作模板，而它的引物的结合位点最好与靶RNA模板的结合位点是相同的。有时，依据一种外源DNA序列正义和反义引物结合位点而扩增产生的合成序列，常常能产生一种合适的参考模板；然后，这种克隆能体外转录出RNA模板，而后者可作为RT-PCR的阳性对照。

　　3、将反应管在95℃加热5

　　min。使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。

　　样品反转录后，反应液中的反转录酶必须使之失活，才能使RT-PCR的扩增阶段能有效地合成产物。有时，反转录酶仅用加热使之失活是不够的。在PCR扩增前，对第一链cDNA用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤予以纯化。据推测，反转录酶的污染会导致扩增反应效率降低。

　　4、调整反应混合液体积，以便正义和反义引物浓度在20 pmol/L。

　　反义寡核苷酸引物（20

　　pmol/L）用于引导第一链cDNA的合成。过量的寡核苷酸引物能导致非特异性序列的扩增；而寡核苷酸引物不足又能导致扩增效率降低。可从制备的cDNA样品中除去过量的寡核苷酸和随机六寡核苷酸引物，然后再调整正义和反义引物的最佳浓度，进一步进行PCR扩增反应。

　　5、离心管内加入如下的反应试剂：1×扩增缓冲液（或调整反应体积到99

　　μl）77 μl，1~2单位热稳定DNA聚合酶1 μl。

　　6、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约50

　　μl）。如果应用热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。

　　7、扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相反的循环条件和温度如下：94℃变性45 s、55℃复性45 s、72℃聚合1 min

　　15 s，35个循环；末轮循环在94℃变性1 min、55℃复性45 s、72℃聚合1 min 15 s下进行。

　　这些循环数设置适应100 μl反应体系在0.5

　　ml薄壁离心管内进行，反应管温育在PCR仪上进行基因扩增。聚合反应应该根据靶基因长度按每分钟聚合1000

　　bp的速率来计算所要设置进行聚合反应的时间。大多数PCR仪设置的最后一个程序是扩增样品在4℃上温育，直到扩增样品从PCR仪上移走。这些扩增样品可在PCR仪上过夜，以后贮存在－20℃中。

　　8、抽取每种扩增样品5~10

　　μl，用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA

　　marker来判断扩增片段的大小。凝胶一般用EB或SYBR金颗粒染色来观察扩增的量与片段大小。

　　一次成功的扩增反应应该产生与我们预期大小一致的DNA片段。扩增条带可用DNA序列分析、Southern杂交和限制性内切酶图谱予以鉴定。

　　9、若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结束后可用150

　　μl氯仿抽提去除。

　　在PCR反应管中，包含扩增DNA片段的水相与上层矿物油的界面形成弯月面，在弯月面下面的水相还有微胶粒。可用自动移液器小心吸取水相液体转移到一个新的离心管中。

　　注意：如果用微量滴定板作为PCR反应孔，就不能用氯仿抽提的方法来去除矿物油。因为这种塑料制品对有机溶液是易腐蚀的。

　　10、在将扩增产物克隆到已经制备好的载体上之前，应从扩增的DNA产物中分离去除残余的热稳定DNA聚合酶和dTNP。然后，DNA片段可以连接到一种平末端载体或T载体，或者限制性酶切后再连接到具有相应末端的载体上。