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  • RT-PCR 没有产物怎么办?

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:1056

      在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物,可能有以下原因。        

        RNA 被降解        

        在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA。使用良好的无污染技术分离 RNA。在将组织从动物体取出后立刻处理。在 100% 甲酰胺中储存 RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂,不要加热超过 45℃ 或 pH 超过 8.0,否则抑制剂或释放所有结合的 RNase。而且,在≥0.8 mM DTT 时加入 RNase 抑制剂,一定要存在 DTT。        

        RNA 中包含逆转录抑制剂        

        通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70%(v/v)乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25 μg 到 0.4 μg/μl)以帮助小量样品 RNA 的恢复。    

        逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。将对照 RNA 同样品混合,同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。        

        多糖同 RNA 共沉淀        

        使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火。确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在 25℃ 保温 10 分钟。对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他 GSP,或换用 oligo(dT) 或随机六聚体确定 GSP 是反义序列。        

        起始 RNA 量不够        

        增加 RNA 量。对于<50ng 的 RNA 样品,可以在第一链 cDNA 合成中使用 0.1 μg 到 0.5 μg 乙酰 BSA。        

        RNA 模板二级结构太多        

        将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。提高逆转录反应温度,对 SuperScriptⅡ可以到 50℃,对 ThermoScript 可以到 65℃。        

        注意:不要在>60℃ 时使用 oligo(dT) 引物,选择一个在反应温度可以退火的 GSP。对于>1kb 的 RT-PCR 产物,保持反应温度≤65℃。不要在高于 37℃ 时使用 M-MLV。如果不需要全长 cDNA,在第一链反应中使用随机引物。        

        引物或模板对残余的 RNA 模板敏感        

        在 PCR 前用 RNaseH 处理。靶序列在分析的组织中不表达 尝试其他靶序列或组织。PCR 没有起作用 对两步法 RT-PCR,不要在 PCR 步骤中使用超过 1/5 的逆转录反应产物        

        PCR 引物设计太差        

        避免在引物  3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计 Tm 类似的引物。DNA 含有抑制剂 诸如 DMSO,SDS 和甲酰胺之类的试剂会抑制 Taq DNA 聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀 DNA。        

        富含 GC 的模板 对于 GC 含量>50% 的模板,使用 PCRx Enhancer Solution。模板浓度太低 使用 10^4 拷贝的靶序列,以在 25 到 30 个循环中获得信号。        

        镁离子浓度太低 从 1 mM 到 3 mM,间隔 0.5 mM 进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量 PCR,使用 3 mM 到 5 mM 的镁离子浓度。        

        退火温度太高 使用公式估算 Tm,把退火温度设定为低于 Tm 5℃。因为这些公式只是估算 Tm 值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。        

        引物浓度太低 最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。为了精确确定引物浓度,在 260nm 测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度

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