共激光扫描共聚焦显微镜的简述

　　共激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope，LSCM）是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。

　　激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近为0%），因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干扰，使得它具有比普通显微镜更高的分辨率，并在生物学中获得了广泛的应用。

　　共聚焦显微镜主要由五部分组成：显微光学系统、扫描装置、光源、检测器和应用软件系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。

　　（1）显微光学系统：

　　显微镜是共焦检测系统常用的组件，是系统成像质量的核心部分。显微镜光路一般采用无限远光学系统结构，可以方便地在其中插入光学元件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径、平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换、滤色片组的选取、载物台的移动调节、焦平面的记忆锁定等都可以由计算机自动控制。

　　（2）扫描装置：

　　扫描装置是激光共聚焦检测系统进行大范围检测必需的组件，通常有由丝杠导轨组成的XY平移扫描、由阵镜摆动的扫描等方式。前种扫描方式可以实现大范围区域的扫描，而后者扫描范围相对小一些，不过阵镜摆动扫描可以很快，图像采集速度可以大大提高，有利于对那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制，与信号采集相对应。

　　（3）光源：

　　光源有单色光（激光）和多色光（汞灯、氘灯、卤素灯等）。激光源可以使用多谱线氩离子激光器，它提供发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光；另外，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器提供波长为633nm的红光。激光源还可以用其他半导体激光器。

　　（4）检测器：

　　检测器通常采用光电倍增管（PMT）、光子计数器等，通过高速A/D转换器，将信号输入计算机以便进行图像重建和分析处理。通常在PMT前设置针孔，可以采用固定大小针孔或由计算机软件来控制的可变大小针孔。如果是检测荧光，光路中还应该设置能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要；也可以采用光栅或棱镜分光然后进行光谱扫描。

　　（5）应用软件系统：

　　应用软件系统可以根据具体需要设置各种功能，但有一点是共同的，就是将扫描位置坐标与检测器接收的信号一一对应起来，并以图像的方式进行储存与显示。

　　共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展，扫描方式从最初的狭缝扫描方式（扫描速度较快，图像分辨率不高），到阶梯式扫描技术（提高了图像分辨率，标本制备要求太高），再到驱动式光束扫描器（扫描速度较快，符合共聚焦原理）。另外，目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进，主要集中在如下几个方面：

　　（1） 现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。选择激光光源时，一方面要满足研究工作对波长的需求，另一个方面要考虑到激光光源的寿命。

　　（2）最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术，配上合适的激光源后，能够摆脱传统的波长滤片组的限制，连续和自由地选择最佳波长。

　　（3）用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进，不但具有平场复消色差特性，而且能与高速扫描功能相匹配。

　　共焦显微镜发展至今又产生了新的类型，如针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜：

　　（1）针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜：

　　针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜是为了解决快速变化过程的共聚焦检测问题而提出的，其核心是双碟片专利技术，由日本Yokogawa Electric公司发明，包括微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转。

　　与常规激光共聚焦方法不同，针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜采用CCD作为探测器，无需载物台进行扫描运动，只要微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转，就可以对物体进行快速共焦检测，最高全幅采集帧速度达到1000帧/s，是活细胞在体荧光成像的重要工具。

　　（2）双光子共聚焦显微镜：

　　双光子共聚焦显微镜是为了解决生物检测中样品染料标记的光漂白现象而提出的，因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，这样就要求激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色（即光漂白现象），荧光信号会随着扫描进程的进行变得越来越弱。除此之外，还有光毒作用问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。针对活性样品的研究，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象将使这些研究受到很大的限制。

　　双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个较低能量（即更长的波长）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个能量较高（即波长为长波长一半）的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子共聚焦显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

　　双光子共聚焦显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子共聚焦显微镜比普通共聚焦显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞，或用来进行定点光漂白实验。

　　共聚焦显微镜有较高的分辨率，而且能观察到样本随时间的变化。因此，共聚焦显微技术在生物学研究领域起着不可或缺的作用。以下为共焦显微技术的几个主要应用方面：

　　（1）组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测：

　　利用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片”，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本，特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。

　　（2）定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化：

　　激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

　　（3）荧光光漂白及恢复技术：

　　利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。

　　（4）长时程观察细胞迁移和生长：

　　目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

　　（5）其他的生物学应用：

　　用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。

　　张旭，徐维奇：《激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用》，《现代科学仪器》2001年第2期

　　黄国亮：《生物医学检测技术概论》，清华大学出版社，2007年