几种高效薄层色谱法的原理汇总

　　薄层色谱扫描仪是今年国家GMP认证重点关注的产品，从年初开始，薄层的询单客户就络绎不绝。薄层的火热主要来源于药典的变更。

　　2015版药典规定多种样品检测需要用到薄层色谱扫描仪，企业要通过GMP认证也必须有带审计追踪功能的薄层色谱扫描仪。目前市场上主流的审计追踪薄层色谱扫描仪主要有KH2000，KH2100,KH3000，KH3500plus,KH3100等。下面为大家介绍几种高效薄层色谱法的原理汇总：

　　薄层色谱，与其他色谱技术的原理一样，是一种利用样品中各组成成分的不同物理特性把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性等。薄层色谱分离一般是由几种分离机理综合的结果，最多的是吸附和分配，也有离子交换或凝胶渗透。鉴于在薄层色谱的过程中，固定相和流动相的特性因分离原理的不同而差别较大，因此，为了方便叙述，现分别将各类型的色谱基本原理以及相关固定相和流动相的技术要求简要介绍如下。

　　第一节 吸附色谱

　　一、吸附色谱的原理

　　吸附色谱法溶解于一相中的混合物的单一组分在另一相界面上会呈现出浓度变化，另一相表面常常出现组分的浓缩，这种现象称之为吸附。吸附性薄层色谱法是将吸附剂在光洁的表面，如玻璃、金属或塑料等表面上均匀地铺成薄层，而后在上面点上样品，以流动相展开，这样，组分不断地被吸附剂吸附，又被流动相溶解，解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，与吸附剂结合较紧密的组分较难被展开剂解吸，而与吸附剂结合较松散的组分则较容易被展开剂解吸。因此在流动相向前流动的过程中，不同组分移动距离不同，原有的混合物就可以得到分离。分离度一般用比移值Rf值来表示，其数值可以通过被分离组分斑点中心离原点的距离与展开剂前沿离原点的距离之比计算出来。

　　二、吸附色谱中对固定相的要求

　　吸附色谱的固定相常称为吸附剂。目前最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，其次是聚酰胺、硅酸镁等，还有一些物质如氧化钙(镁)、氢氧化钙(镁)、硫酸钙(镁)、磷酸钙(镁)、淀粉、蔗糖等，但因碱性太大或吸附性太弱，致使用途有限;而活性炭的吸附性太强，本身又是黑色，故很少用于色谱分离。具体要求如下：

　　①具有大的表面积和足够的吸附能力;

　　②对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好地分离不同的化学成分;

　　③在所用的溶剂和展开剂中不溶解;

　　④不破坏或分解供试品中各组分，不与供试品中溶剂和展开剂起化学反应;

　　⑤颗粒大小均匀，一般要求直径小于70u.m(小于250目)且在使用过程中不会碎裂;

　　⑥具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸附;

　　⑦为便于观察分离结果，最好是白色固体。

　　三、吸附色谱中对流动相的要求

　　流动相的选择必须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行色谱分离时，当被分离物质为弱极性物质时，一般选用弱极性溶剂为展开剂;被分离物质为强极性成分时，则需选用极性溶剂为流动相。如果对某一极性物质使用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶)，则流动相的极性亦必须相应降低。

　　在薄层色谱中，当吸附剂活度为一定值时(如Ⅱ级或Ⅲ级)，对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。而展开剂的选择原则主要还是根据被分离物质的极性选择相应极性的展开剂。

　　第二节 分配色谱

　　一、分配色谱的基本原理

　　分配色谱法是利用混合物的各个组分在两相溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种色谱方法。但需将两相溶剂中的一相，设法固定在某一固体物质上。这样的固体物质，如硅藻土、纤维素粉等，常称为载体。被载体吸收的溶剂，称为固定相。第二相缓慢地在固定相表面上流动，故被称为流动相。然而，这两相必须是平衡以后相互饱和，否则将会在色谱分离过程中出现所用溶剂系统的浓度变化。在色谱过程中，当展开剂流经原点时，被测混合物中的不同物质即在两相之间进行分配，每展开一点距离，被分离物质都接连不断地重复地进行着分配。溶质在固定相中的物质的量浓度与其在流动相中的物质的量浓度之比常称为分配系数，分配系数小的物质，即在流动相中溶解得多的物质，随流动相移动的距离就较大，Rf值大;反之，分配系数大的物质，移动的距离较小，Rf值小。所以经过一定距离展开后，分配系数不同的物质逐渐拉开距离，进而达到分离的目的。一般常用于极性大的成分，如糖、氨基酸、羧酸类、酚类等。

　　在分配色谱法中的两相系统内，如一相含有机溶剂较多，而另一相含水较多。水相通常固定在固体亲水性载体上，例如硅胶、硅藻土、淀粉、亲水性凝胶、粉状纤维索、滤纸等。有机相通常是流动相，这种方法称为正向色谱法。如果以疏水性材料的载体用有机相浸渍饱和，而水相是流动相的话，那么这种方法就称之为反向色谱法。在一些特殊的情况下，用这种方法可以获得更好的分离效果。

　　二、分配色谱中对固定相的要求

　　分配色谱的固定相常被称为载体，最常用的载体有纤维素和硅藻土等。作为分配色谱的载体需要具备以下条件：

　　①应为中性多孔粉末，对样品组分无吸附性或吸附性极弱。在色谱过程中不溶于展开剂系统中，与展开剂和样品组分不起化学反应。

　　②能吸住一定量的固定相，对固定液是惰性的，并不改变其组成，而流动相又能自由通过。

　　③表面积大，吸住的固定相应尽量多，最好能达到载体重量的50%以上。如硅藻土作为分配色谱的载体效果很好，因为硅藻土可吸收其重量的100%的水，而几乎无吸附性能，它们主要应用于分离蛋白质、核酸、酶、糖等物质，在生化方面应用较多。

　　三、分配色谱中对流动相的要求

　　构成分配色谱的溶剂系统种类繁多，一般针对被分离化合物的性质进行选择，大多数是采用复合的溶剂系统，可通过调节溶剂系统的性质，使之与被分离的化合物性质相适应。例如，一个强极性溶剂A与一个弱极性溶剂B混合，通过改变其组成比例，可得到一系列中极性强度的流动相系统。表2—1就是根据被分离化合物的性质得到固定相与流动相之间的关系。

　　第三节 离子交换色谱

　　一、离子交换色谱的基本原理

　　离子交换色谱适用于氨基酸、蛋白质、蛋白质水解物以及其他离子型化合物。以离子交换树脂作为固定相，用水或与水混合的溶剂作为流动相。在流动相中存在的离子性物质与树脂进行离子交换反应而被吸附，代替了因吸附表面活性所产生的吸附作用。离子交换色谱的分离原理主要表现在以下3个方面：

　　①利用样品组分的选择性系数不同而进行分离;

　　②利用各组分解离度的差别而进行分离;

　　③形成络离子后进行离子交换分离。当树脂的种类、性质和实验条件保持一定以及流动相的各离子强度保持一定时，被分离组分离子在固定相(树脂)和流动相(溶液)之间的浓度之比是一个常数，此常数称为分配系数。分配系数值的大小决定组分离子在树脂上的保留时间，分配系数值大，则溶质的保留时间长。

　　二、离子交换色谱中对固定相的要求

　　离子交换树脂分为两大类，即阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。离子交换树脂的树脂核是由苯乙烯通过二乙烯基苯链聚合而成。二乙烯基苯在离子交换树脂中所占的重量百分比称为“交联度”。交联度可反映树脂的网眼大小。交联度越大，树脂内的孔洞就越小，大分子物质就不易进入树脂颗粒之内。例如分离氨基酸或小分子肽(二肽或三肽)，以8%交联度的树脂为宜;而对分子量较大的肽，则以选用2%～4%交联度较小的树脂为适宜。一般只要不影响分离的完成，以采用交联度较高的树脂比较适宜。因为交联度高，网眼小，组成紧密，性质较稳定，不易破坏，寿命长。但由于网眼小，分子小的离子可进去，分子大的离子进不去，也就是交换不上，因此表现为交换容量小，而选择性强。

　　一般情况下，将离子交换树脂按交联度的大小分为三级，根据不同需要选择应用。如制造离子交换水以选用高交联度树脂较好，分离大分子物质则需应用低交联度的树脂，见表2—2。

　　三、离子交换色谱中对流动相的要求

　　离子交换色谱展开剂的选择要依据被分离化合物的酸碱性，可用各种类型的缓冲液或盐溶液作为展开剂。选择展开剂的前提是根据被分离化合物是酸还是碱，是阴离子还是阳离子来选择。为了使这些离子型化合物得到较好的分离，点样前必须用水或0.1mol/L氯化钠溶液对薄层板展开一次，即可使离子交换薄层得到再生或活化。

　　由于水是优良的溶剂并具有电离性，因此大多数用离子交换树脂进行色谱分离时，都是在水溶液中进行的。有时亦采用水/甲醇混合溶剂，因为在水相展开剂中加入少量能与水混溶的有机溶剂可以增加样品组分的溶解度并且改变溶剂的分离选择性，还可以减少某些组分的拖尾现象。缓冲液用来控制展开剂的pH值，如在阳离子交换树脂中，经常采用醋酸、枸橼酸、磷酸缓冲液;在阴离子交换树脂中，则采用氨水、吡啶等缓冲液。另外也可通过加入某些盐类溶液来调节展开剂的离子浓度。

　　常用的离子交换色谱展开剂有四种类型：

　　①pH=3.0～8.0的各种离子强度的缓冲溶液，如pH8.0的0.005mol/L磷酸缓冲液或pH3.4的2mol/L氯化钾或氯化钠溶液;

　　②盐溶液，如0.1～2.0mol/L氯化钾或氯化钠溶液;

　　③蒸馏水;

　　④在上述各种展开剂中加入少量有机溶剂如甲醇、四氢呋喃、乙腈等。

　　第四节 凝胶色谱

　　一、凝胶色谱的基本原理

　　以凝胶为固定相的色谱，称为凝胶色谱。葡聚糖凝胶的分离原理是葡聚糖凝胶在吸水后形成凝胶粒子，在其交联键的骨架中有许多一定大小的网眼。网眼大，大分子物质能进入网眼内;网眼小，只有小分子物质才能进入网眼;而超过一定限度的大分子物质，就被排阻在凝胶粒子的外部而不能进入网眼。这就使得能进入凝胶内部与不能进入凝胶内部的分子，如同按照分子大小过筛一样，所以称为分子筛。操作时首先将凝胶在适宜的溶剂中浸泡，使其充分膨胀，然后再铺成薄层，加入样品后，再以同一溶剂洗脱，则样品中大分子化合物不能进入凝胶颗粒内部，只在凝胶颗粒间移动，因此阻力小，行动快，走在前面;而小分子化合物能自由扩散进入到凝胶内部，因此在色谱时受到的阻力较大，行动慢，走在后面。如此经过一段时间的洗脱，混合物中各组分就会按照分子的大小而获得分离。

　　二、凝胶色谱中对固定相的要求

　　胶色谱常用的凝胶是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶常被分为亲水性葡聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离子交换剂三大类。

　　亲水性葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖酐，dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂表氯醇使葡聚糖交联聚合而成，其商品名为Sepha—dex。加入交联剂量不同可制成不同交联度的凝胶，因此其应用范围也有所不同。不同交联度商品凝胶的吸水程度及应用范围等情况见表2-3。

　　制备凝胶薄层时与一般薄层有所不同，首先用于薄层色谱的凝胶颗粒要细(小于40um)，交联度要低(G-50以下)。因交联度大的凝胶不易制板。此外，在制备凝胶薄层时还应注意以下几点。①凝胶预先必须用水或缓冲液浸泡，使之充分膨胀后，经放置沉降，再倾去上层浸泡液即可铺制薄层，不需黏合剂，但玻璃板必须洁净，否则铺不好。②铺好的湿薄层需置于特制的展开槽中，薄层的上、下两端连上厚滤纸条，以下行法(薄层与水平约成20°角)从薄层上端将展开剂引到薄层上，使薄层饱和或达到平衡(约需12h)，然后洗脱液由薄层下端流人储液槽内。③薄层达到平衡后，需通过展开槽盖上的小孔点样品溶液。④由于凝胶薄层一直为潮湿状态，所以展开剂的前缘不容易察见。⑤展开速度很慢，一般不超过4cm/h。

　　葡聚糖凝胶只能用于水溶性物质，但在葡聚糖分子上引入有机基团，则可使之成为亲脂性葡聚糖凝胶。如在G-25凝胶上引入羟丙基基团，与糖分子以醚键相连，使之成为既有亲水性又有亲脂性的LH-20葡聚糖凝胶，适用于有机物，如黄酮、蒽醌、色素等成分的分离。

　　葡聚糖凝胶离子交换剂在G-25或G-50葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基(SP，一C3H7SO3H)、二乙基氨乙基及季铵乙基等制成的既具有凝胶的优点又具离子交换性质的载体，在生化及天然化合物方面得到广泛应用。这些离子交换剂在水、盐溶液、弱碱溶液、弱酸溶液及有机溶液中较稳定，但在强酸溶液中易水解，所以应避免在pH值小于2的溶液中操作。

　　三、凝胶色谱中对流动相的要求

　　凝胶薄层常用于高分子的非离子化合物的分离，如蛋白质及核酸等，用此法可以分离不同分子量的混合样品，常用的展开剂是水或盐类的水溶液、缓冲液等。在凝胶薄层展开剂中常加入适量的盐类，以保持其离子强度，避免在离子型样品通过凝胶薄层时导致凝胶收缩及渗透率减低。

　　第五节 其他薄层色谱

　　一、微乳薄层色谱法

　　与一般常用的薄层色谱法不同，微乳薄层色谱法是以微乳液为流动相的薄层色谱法。微乳液是将不同配比的表面活性剂、助表面活性剂、油、水等组分组合在一起，使其自发生成一种无色透明、各向同性、低黏度的溶液，属于缔合胶体溶液。微乳体系的组成与胶束体系相似，但比胶束体系具有更大的增溶量。微乳液具有更大的增溶量和更低的界面张力，更有利于提高色谱效率。在微乳薄层层析过程中，溶质在固定相、微乳液的水连续相及油核和界面膜数相之间产生不同比率的分配，由于微乳液的增溶作用，极性大的分子分配于微乳水连续相中，极性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性剂与助表面活性剂组成的膜栅栏中，加上吸附、静电、疏水、立体等其他多种综合的效应，使混合组分在微乳液中展开时迁移速度不同，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质。此外，本法对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离差别很小的物质。

　　二、胶束薄层色谱法

　　胶束色谱是一类应用一定浓度的表面活性剂溶液所形成的胶束溶液作为流动相的色谱。自1979年美国科学家Armstrong首次采用胶束薄层色谱法成功地分离测定农药后，胶束色谱法在理论和实践上均取得了显著进展。表面活性剂分子的化学结构包括亲水基和疏水基，如十二烷基硫酸钠。在极性溶剂如水中，由于和极性亲水基(硫酸基)之间有排斥作用，非极性疏水基(烷基长链)之间有缔合作用，故几十个表面活性剂分子聚合成团，形成亲水基向外、疏水基向内的正胶束;而在非极性溶剂中情况则相反，极性基团聚集成亲水性内核，而亲脂性的非极性基团向着外部的有机溶剂，形成逆胶束。正胶束溶液对于原来不溶或微溶于水的有机化合物有增溶作用。对于苯、甲苯这类非极性分子，由于分子溶解在胶束的亲脂性内核中，故溶解度增加;对于水杨酸、酚类等稍带极性的分子，分子的非极性部分插入胶束内核，极性部分伸在外层亲水基团中间，结果同样造成增溶;而羧基苯甲酸这种强极性分子，则可吸附在胶束的亲水基表面而得到增溶。由于胶束的增溶作用，用胶束溶液作为色谱流动相时，原来组分在液固两相间的分配变成了组分在胶束、水相和固定相三相问的分配平衡。各组分之间因分配系数不同，而达到分离。

　　胶束薄层色谱根据所用胶柬溶液的不同又可分为正胶束薄层和逆胶束薄层。正胶束薄层一般采用聚酰胺、氧化铝、硅胶作固定剂，表面活性剂的水溶液，如十二烷基硫酸钠水溶液等作展开剂，而逆胶束薄层一般采用硅烷化的硅胶作固定相，表面活性剂的有机溶液加入少量水，如丁二酸二辛酯磺酸钠的环己烷溶液中加入少量水后作展开剂，可解决其分离效率不高或斑点略有拖尾等问题。采用正胶束薄层色谱，可以用胶束溶液代替有机溶液展开分离许多原来在水中不溶或微溶的药物，既可避免使用挥发性大、对人体有害的有机溶剂，又能降低成本。

　　胶束色谱还可用于薄层扫描，又称为胶束薄层色谱扫描法;类似的还有胶束高效液相色谱和胶束电动毛细管色谱。

　　胶束高效液相色谱大多采用反相色谱柱LC-18、LC-CN等，流动相多用SDS水溶液或用其他表面活性剂水溶液。用胶束高效液相色谱分析血浆样品时，因血浆蛋白大分子不能像脂溶性药物小分子一样进入胶束内部，故会首先洗脱出峰。因此采用胶束色谱能使体液样品不经前处理直接进样。胶束色谱的这种特点已在生物样品中的药物及代谢物测定上得到了广泛应用。

　　胶束电动毛细管色谱是一种基于胶束增溶和电泳移动的新型色谱。当样品进入毛细管后，在水相和胶束相中进行分配，在水相中分配较多的组分移动速度快，在胶束相中分配较多的组分移动速度慢。因此，各种组分可以根据它们在两相中分配不同而得到分离。胶束电动毛细管色谱的特点在于它弥补了普通电泳法不能分离中性化合物的不足，可用于许多电中性药物的分离测定。

　　三、反相薄层色谱法

　　反相薄层色谱是利用化学键合反应，将烃基硅烷键合到硅胶表面，制成非极性固定相，用极性较大的液体作流动相进行分离分析的方法，可克服疏水板对溶剂、系统的限制，其流动相含水量根据键合相不同可达20%～80%不等。常用展开剂是水和甲醇混合溶剂，其次是水和乙腈，并可使用强酸或强碱作流动相。本法可用于极性、极性化合物的分离，甚至水溶性化合物的分离。并可按理论和预期方法选用溶剂系统，因为Rf值与流动相中的有机改性剂含量之间呈线性关系。本法回收率高，重现性好，薄板可重复使用。