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  • HPLC系统的组成及介绍

    文/ 发布于2018-12-25 浏览次数:3002

      HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等,现代HPLC仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

      最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪,绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱,柱填料从单一品种发展至几百种类型,检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪,逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。

      目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司(原HP公司)、岛津公司、奥普斯等,国内有河南奥普斯、大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

      输液泵

      1.泵的构造和性能

      输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能:①流量稳定,其RSD应<0.5%,这对定性定量的准确性至关重要;②流量范围宽,分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调,制备型应能达到100 ml/min;③输出压力高,一般应能达到150~300 kg/cm2;④液缸容积小;⑤密封性能好,耐腐蚀。

      泵的种类很多,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响,流量不稳定;螺旋泵缸体太大,这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。

      柱塞往复泵的液缸容积小,可至0.1ml,因此易于清洗和更换流动相,特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量,流量不受柱阻影响;泵压可达400 kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大,现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和***式,一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为0.1%左右,***泵为0.2~0.3%),但出故障的机会较多(因多一单向阀),价格也较贵。

      2.泵的使用和维护注意事项

      为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性,必须按照下列注意事项进行操作:

      ①防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏,而常用的方法是滤过,可采用Millipore滤膜(0.2μm或0.45μm)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

      ②流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此,必须泵入纯水将泵充分清洗后,再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。

      ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。

      ④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变形,产生漏液。

      ⑤流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大量气泡,泵就无法正常工作。

      如果输液泵产生故障,须查明原因,采取相应措施排除故障:

      ①没有流动相流出,又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体,这时可打开泄压阀,使泵在较大流量(如5ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损,需更换。

      ②压力和流量不稳。原因可能是气泡,需要排除;或者是单向阀内有异物,可卸下单向阀,浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡,或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞,这时,可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡,或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物,或将

      盐溶解,再立即清洗。

      ③压力过高的原因是管路被堵塞,需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

      3.分离系统 该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

      

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