高效液相色谱分析法

　　高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达29.4MPa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测

　　1.高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×10Pa。

　　2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

　　3. 高效：HPLC的分离效率高于普通液相色谱，在发展过程中又出现了许多新型固定相，使分离效率大大提高。

　　4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般微升。

　　5. 适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

　　（一）高效液相色谱分析的流程

　　由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，

　　而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

　　（二）高效液相色谱的分离过程

　　同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

　　开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分Ｃ 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

　　不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

　　（一）吸附色谱

　　在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。

　　吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为10％或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。

　　（二）分配色谱

　　1. 正相分配色谱

　　正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。

　　2.反相分配色谱

　　这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。

　　通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的ＰＨ值，例如，如果样品有一个—ＣＯＯＨ 基团，使流动相的ＰＨ值是偏向酸性的，由于抑制了—ＣＯＯＨ基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。

　　在调节ＰＨ值中，保持ＰＨ值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在ＰＨ＝2-9，然而，当加入盐以后，最好使其ＰＨ＝7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的ＰＨ值。

　　（三）离子交换色谱

　　这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。

　　离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、ＰＨ及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用ＮａＣＩ或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在210ｎｍ，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。

　　（四）凝胶色谱

　　凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。

　　因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。

　　凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。

　　1.凝胶渗透色谱

　　凝胶渗透色谱（ＧｅｌＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＰＣ。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如ＰＶＣ，ＰＳ，ＡＢＳ等等，而所用的洗脱液有ＴＨＦ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ等等。

　　2.凝胶过滤色谱

　　凝胶过滤色谱（ＧｅｌＦｉｌｔｒａｒｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＦＣ。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。

　　凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。

　　1 作为分析手段使用

　　分为单独使用和与其他分析设备配套使用两种形式。

　　单独使用的应用范围已经十分广泛，是常规的仪器分析手段，相关的国家标准也很多，2015年正在执行的已经超过600项。

　　比如：

　　GB/T 30388-2013 辣椒及其油树脂 总辣椒碱含量的测定 高效液相色谱法

　　GB/T 25224.2-2010 动植物油脂 植物油中豆甾二烯的测定 第2部分:高效液相色谱法

　　GB/T 17528-2009 胡椒碱含量的测定 高效液相色谱法

　　配套使用主要是与质谱等设备联用，能够有效的确定混合物样品或者是未知物样品的组分。

　　比如：

　　GB/T 29664-2013 化妆品中维生素B3(烟酸、烟酰胺)的测定 高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法

　　GB/T 23217-2008 水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法

　　2 作为微量分离手段使用，详见“制备色谱”词条

　　称之为高效液相制备色谱。在将物质分离后进行分别收集，实现微量物质的分离。

　　这在高端化学品，比如手性药物中间体的制备中，非常常见。

　　（一）食品中山梨酸、苯甲酸的测定

　　1. 原理

　　样品加温除去二氧化碳和乙醇，调ＰＨ至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

　　2.试剂和溶液

　　方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。

　　（1）甲醇：优级纯，如果是分析纯，需重蒸。

　　（2）稀氨水：1+1 溶液，氨水加水等体积混匀。

　　（3）0.02ｍｏｌ／Ｌ乙酸铰溶液：称取1.54ｇ乙酸按，加水至1000ｍＬ，溶解，经滤膜（0.45ｍ）过滤。

　　（4）20ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液：称取2ｇ碳酸氢钠（优级纯）加水至100ｍＬ，振摇溶解。

　　（5）苯甲酸标准储备液：准确称取0.1000ｇ 苯甲酸，加20ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液5ｍＬ，加热溶解，移入100ｍＬ 容量瓶中，加水定客至100ｍＬ，摇匀，此溶液苯甲酸含量为1ｍｇ／1ｍＬ，作为储备液。

　　（6）山梨酸标准储备液：准确称取0.1000ｇ.山梨酸，加碳酸氢钠溶液（20ｇ／Ｌ）5ｍＬ，加热溶解，移入100ｍＬ 容量瓶中，加水定容至100ｍＬ，山梨酸含量为1ｍｇ／1ｍＬ，作为储备溶液。

　　（7）苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液10.0ｍＬ，放入100ｍＬ容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1ｍｇ／ｍＬ。经滤膜（0.45ｍ）过滤（ 同时测定糖精钠时，可加入糖精钠标准储备液）。

　　3.仪器高效液相色谱仪（带紫外检测器）。

　　4.测定方法

　　（1）样品处理

　　1.汽水、饮料、果汁类：（ 汽水需微温搅拌除去二氧化碳）吸取2.0ｍＬ 样品，加入已装有中性氧化铝（3ｃｍ*1.5ｃｍ）的小柱中，过滤，弃去初滤液，然后用流动相洗脱苯甲酸，接收于25ｍＬ带塞量简中，洗脱至刻度，摇匀。此液通过微孔滤膜后进样。

　　3.配制酒类：称取10.0ｇ 样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调节ＰＨ约7，加水定容至适当体积，经滤膜（0.45ｕｐ）过滤。

　　（2）高效液相色谱参考条件

　　1.色谱柱：ＹＷＧ-Ｃ184.6*150ｍｍ5ｕｐ，或其他型号Ｃ18柱。

　　2.流动相：甲醇+乙酸铰溶液（0.02ｍｏｌ／Ｌ）（5+95）。

　　3.流速：1.0ｍＬ／ｍｉｎ。

　　4.进样量：10ｕｌ。

　　5.检测器：紫外检测器，波长230ｍｍ，灵敏度0.2ＡＵＦＳ。

　　根据保留时间定性、外标峰面积法定量。