菜籽多糖的制备、表征及体外活性

　　 菜籽粕是菜籽榨油后的副产物。菜籽多糖的研究与开发有利于菜籽粕的综合利用。对于菜籽多糖的结构国外已有一些研究,而对于其功能活性则未见有文献报道。本文以华杂4号“双低”菜籽粕为原料,利用傅里叶变换红外光谱学(FT-IR)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱质谱联用(GC-MS)、核磁共振(NMR)对分离纯化得到的菜籽多糖进行组成和结构表征,并采用化学发光分析评价其体外清除自由基能力,MTT法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等细胞生物学和分子生物学方法研究了菜籽多糖对脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。主要研究结果如下:

　　1菜籽多糖的制备及表征。菜籽多糖的制备及表征国外已有较多研究。本文重点研究了华杂4号菜籽粕中多糖的提取优化条件、绿色环保的纯化工艺以及表征方法。

　　1.1经过前处理的脱脂菜籽粕,按照中心组合实验(CCD)得到的水溶性多糖提取优化工艺条件,即以水按液料比为28:1(mL/g)在94℃浸提2.9 h,一次提取菜籽多糖得率为2.18%,连续提取三次将水溶性多糖提取殆尽。剩余的残渣料再以5%NaOH溶液作提取剂,按料液比1:20,60℃提取2 h,得到的提取液以4 M HCl溶液中和至pH=5。得到的水溶性多糖和碱溶性多糖两部分提取液分别经筛选出的特1号大孔吸附树脂柱层析、分步醇沉、DE-52纤维素离子交换柱层析等方法纯化,分别得到各自的主要级分WPS-1和APS-2。WPS-1和APS-2再通过葡聚糖凝胶G-200柱层析和凝胶渗透色谱(GPC)进行纯度鉴定,结果表明WPS-1和APS-2都是相对均一多糖。

　　1.2 WPS-1和APS-2均为白色絮状的非淀粉多糖;中性糖含量分别为83.2%和66.8%;糖醛酸含量分别为6.1%和9.3%;蛋白质含量分别为3.78%和8.65%。WPS-1和APS-2中蛋白质部分都由天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等9种氨基酸组成。GPC法测定WPS-1和APS-2的重均分子量(M_w)分别为7.20×10~5和1.61×10~5,数均分子量(M_n)分别为2.45×10~5和6.79×10~5。FT-IR、GC、HPLC初步分析WPS-1和APS-2的官能团特征及单糖组成,确定WPS-1单糖主要由阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)组成,其摩尔百分含量分别为66.6%、18.3%、12.6%、2.51%;APS-2单糖组成包括Ara、Gal、Glc、甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalA)、GlcA、Rha摩尔百分含量分别为52.8%、21.7%、10.6%、5.0%、4.8%、3.6%、1.4%。通过甲基化分析以及一维NMR(包括~(13)C NMR和~1H NMR)对WPS-1的结构表征进行了研究,结合前人的相关研究成果,得出WPS-1的主体部分是主要是由(1→5)键和(1→2)键连接的Ara残基组成的多支链α-阿拉伯聚糖。

　　2菜籽多糖的体外活性。菜籽多糖的生物活性本实验室曾作初步研究,国内外未见有菜籽多糖生物活性的报道。本文重点从细胞、分子水平上研究了菜籽多糖的生理活性。

　　2.1分别采用邻苯三酚-鲁米诺、硫酸铜-邻菲哕啉-抗坏血酸-双氧水、鲁米诺-双氧水三种化学发光体系,通过微弱发光测量仪测定了WPS-1和APS-2对超氧阴离子(O_2~(·-))、羟基自由基(HO~·)和双氧水(H_2O_2)三种ROS的体外清除作用。结果表明WPS-1和APS-2对各ROS都有良好的体外清除作用,且都呈剂量-效果关系。WPS-1和APS-2在实验最高浓度2000μg/mL时,对O_2~(·-)的极大抑制率分别为90.4%和89.6%。WPS-1和APS-2对O_2~(·-)的半数抑制浓度(IC_(50))分别为400±44μg/mL和450±64μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除O_2~(·-)能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度1000μg/mL时,其对HO~·的极大抑制率分别为93.8%和86.7%。WPS-1和APS-2对HO~·的IC_(50)分别为240±18μg/mL和293±24μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除HO~·的能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度50μg/mL时,其对H_2O_2的极大抑制率分别为84.2%和85.2%。WPS-1和APS-2对H_2O_2的IC_(50)分别为10.0±0.8μg/mL和6.1±0.5μg/mL。APS-2清除H_2O_2的能力略强于WPS-1。比较IC_(50)值,WPS-1和APS-2对各自由基的清除能力都表现为:H_2O_2＞HO~·＞O_2~(·-)。

　　2.2采用尼龙毛柱法从脾淋巴细胞分离T、B淋巴细胞。通过MTT法检测,菜籽多糖对总脾淋巴细胞和T淋巴细胞具有明显的增殖活性,并表现出明显的剂量-效果关系,增殖的最佳浓度为40μg/mL,并且WPS-1比APS-2作用效果更好。采用半定量RT-PCR进一步研究菜籽多糖WPS-1对T淋巴细胞分泌的细胞因子白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、干扰素γ(IFN-γ)mRNA表达的影响。首先研究了各细胞因子mRNA随WPS-1作用时间的变化,WPS-1促进IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表达最佳作用时间都为24 h,而促进IFN-γmRNA表达的最佳作用时间为12 h。采用各细胞因子mRNA表达的最佳作用时间,进一步考察WPS-1浓度的影响,得到其对促进IL-2、IL-6、IFN-γmRNA表达的最佳浓度都为40μg/mL,而对IL-4则为20μg/mL。菜籽多糖可能对淋巴细胞的免疫功能具有调节作用。

　　2.3采用MTT法检测细胞的活性,菜籽多糖能促进巨噬细胞增殖,并表现出明显的剂量-效果关系,菜籽多糖促进巨噬细胞增殖的最佳浓度为40μg/mL,WPS-1比APS-2对巨噬细胞增殖活性的促进作用略大。菜籽多糖对巨噬细胞的影响与对T淋巴细胞的检测结果相类似,。采用半定量RT-PCR进一步研究不同作用时间下40μg/mL菜籽多糖WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)这两种细胞因子以及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量最大的时间为24 h。菜籽多糖可能对巨噬细胞的免疫功能具有调节作用。