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  • 气相色谱中,程序升温时,柱温N阶程序如何确定,是否N越大越好? 技术前沿 中国标准物质网

    文/ 发布于2018-09-17 浏览次数:1639

      (1) 提出问题 气相色谱中,根据升温方式,程序升温可分为线性程序升温和非线性程序升温,前者更普遍。线性程序升温,即随时间线性变化的升温方式,可分为一阶线性程序升温和N阶线性程序升温。对于每阶程序升温,都包含初温、程序升温速率、终温以及不同温度下的保持时间四个基本参数。

      气相色谱恒温分析中,对化学性质相似的同类型的化合物,保留时间和沸点呈对数关系,随着保留时间增加,峰宽迅速增加,导致先流出峰相互叠加,后流出峰又因峰展宽,使检测灵敏度下降。因此一般通过柱温程序升温来解决这个问题。

      那么,程序升温时,柱温N阶程序如何确定,是否N越大越好?

      (2) 分析原因 程序升温时,在最佳分离条件下,保留时间与沸点近似成线性关系,即随着柱温的升高,峰底宽基本不变或增加很小。程序升温中各组分均在最佳柱温下出峰,但并不是N越大越好。

      (3) 解决方案 气相色谱分析中,对于组分沸点范围窄、化学性质类似的样品,如同系物,可选用一阶升温;样品组分沸点范围宽、性质差异大的,应选择N阶程序升温。N应根据化合物的多少、需要达到的分离效果、仪器的条件等各方面来选择。

      每阶程序升温中,设置初温、程序升温速率和终温这三个基本参数优化分离条件,要从分离效果和分析速度两方面考虑。

      对于初温,一般比样品中沸点最低的组分沸点要低,可参考低沸点组分恒温分析时的温度。初温的选择,主要是依据低沸点组分,但要高于固定液的凝固温度。

      升温速率的选择,在了解样品组分复杂程度的基础上,既要保证较小的保留时间,又要保证较大的分离度,一般在0~10℃/min之间。

      终温的选择,主要根据固定相、样品组分的热稳定性和高沸点组分的沸点确定。同样的样品组分,流出时的柱温,在毛细管柱上的温度比填充柱低,毛细管柱上的温度一般比样品的沸点约低50℃。

      (4) 案例分析 采用5%SE-30填充色谱柱(3m×3mm),在柱前压120kPa、汽化室温度240℃、氢火焰检测器温度260℃、柱温程序升温条件下,分离含有正己烷、环己烷、甲苯、苯乙烯、对二甲苯、邻甲酚、间甲酚和异烟酸乙酯的混合物。

      先尝试一阶程序升温分离,初温90℃,35℃/min升到210℃并保持3min,有两对化合物(4、5和6、7)没有完全分离。

      改变为三阶程序升温条件,初温90℃:保持3min,15℃/min升到120℃保持2min,再15℃/min升到180℃保持2min,40℃/min升到220℃保持2min,之前未分离的两对化合物达到分离,但异烟酸乙酯含有酯基,且流出时柱温低,峰形依旧不好。

      继续优化分离,初温100℃保持4min,15℃/min升到115℃保持2min,再30℃/min升到175℃保持1min,再50℃/min升到220℃保持2min。正己烷、环己烷流出温度100℃,甲苯、苯乙烯流出温度为115℃,对二甲苯流出温度为115℃,邻甲酚流出温度为175℃,间甲酚流出温度在175~187℃之间,异烟酸乙酯流出温度为220℃,峰形相对较理想。

      因邻甲酚、间甲酚和异烟酸乙酯为极性物质,由上面可见,峰形拖尾严重,因此尝试换成PEG20M毛细管柱(20m×0.25mm×0.30um)进行分。低沸点组分和三个沸点接近的组分没有分开。

      改变柱温升温程序,初温40℃保持3min,18℃/min升温至180℃,保持2min,结果先出峰的低沸点组分没有分开,其他的都达到基线分离,继续优化柱温升温程序,降低柱初始温度,初温31℃保持2min,25℃/min升温至180℃保持2min,结果低沸点组分仍不能分开。正己烷、环己烷流出温度31℃,甲苯流出温度31℃,苯乙烯流出温度31~32℃,对二甲苯流出温度58~60℃,异烟酸乙酯流出温度151~158℃,邻甲酚流出温度162~171℃,间甲酚流出温度172~180℃。

      比较样品在填充柱和毛细管柱上的分离,同样的样品组分,在填充柱上的流出温度比毛细管柱上的流出温度高。在保证分离效果的前提下,N尽可能少,以简化操作,同时尽量让峰流出时温度处在恒温阶段或温度变化小的状态。

      (1) 提出问题 气相色谱是将样品汽化后导入色谱柱进行分离分析,柱温直接影响样品中各组分的色谱行为。多数情况下,大部分样品组分复杂、沸程较宽,这种情况下,如果使用恒温分析,则各组分难以完全分离并且峰形较差。同时以低极性色谱柱为例,宽沸程的复杂样品在恒温模式下进行分析,柱温设定太高则分离度下降,柱温设定太低则分析时间延长。因此,应该用柱温程序升温方法来改善后流出组分的峰形。

      (2) 分析原因 为改善色谱峰峰形及分离效果,一般可通过改变柱温或更换色谱柱来实现,二者比较,改善柱温最为常用且方便。

      通常在选择柱温条件时,有恒温和程序升温两种方法。程序升温色谱法类似于液相的梯度洗脱,是指进样后,在一次样品分析的时间周期内,色谱柱的温度按照根据组分沸程预先设置的程序连续地随时间线性或非线性变化逐渐升高,就会使样品中的各个组分的分配系数都处于连续变小的状态,使它们在气相中的浓度不断提高,检测器可在较短的时间内连续接收到高浓度的各个组分,使其都在最佳柱温(或称保留温度)下逸出,而获得满意的分离度和相接近的柱效,从而使样品中各个组分实现完全的分离,并缩短了总分析时间,且让各化合物获得较好的峰形。

      (3) 解决方案 目前,程序升温是改善复杂混合样品分离最主要的手段。采用柱温程序升温方式,可有效分离多组分、宽沸点范围的复杂样品,由于初温较低,在逐渐升温的过程中不同沸点的物质逐渐汽化最终在柱子中分离开。程序升温的条件,包括起始温度、维持起始温度的时间、升温速率、最终温度、维持最终温度的时间,通常都要反复实验加以选择。

      针对复杂的样品,一般先设定一个升温程序,初温40℃或50℃不保持,以10~20℃/min升温速率升至最高温度,如280~300℃,最高温度视色谱柱的温度上限而定。记录色谱图,观察分离情况:如果在一段时间内出现空白或色谱峰非常少,根据升温程序计算这一段时间的温度,然后提高其升温速率;若某一段时间内出现大量的色谱峰堆积,根据升温程序计算这一段时间的温度,降低其升温速率,若仍然分不开,则在本段时间升温起点的温度保持5~10min,观察其分离,反复调整至分离度、所有峰形良好。

      (4)案例分析 利用Agilent 5975—6890N GC-MS分析干姜超临界萃取物,以程序升温方式1:初温50℃,10℃/min升温至250℃分析,得到色谱图。由于该样品为超临界萃取物,组分沸点较高,以恒定的升温速率做线性程序升温时前10min基本没有组分流出,色谱峰主要集中在后半段,且分离效果不佳,因此单阶线性升温程序不能满足分离要求,应进行多阶程序升温条件优化。调整程序升温为:初温125℃,2℃/min升温至160℃,保持5min后,以20℃/min升温至210℃,再以10℃/min升温至250℃,提高初始温度,可以使组分较快地流出色谱柱,减小升温速率可以使各不同沸点组分出峰时问间隔变长、分离度增大,获得优化结果。

      (1) 提出问题 气相色谱常用于分析组分复杂、沸点差异大的样品,检测器是气相色谱的“眼睛”。

      要保证样品组分的分离效果,必须考虑检测器的温度设定。温度设定太高,会增大组分的响应值和基线噪声,降低仪器的灵敏度;温度设定太低,样品组分会在检测器内冷凝、不出峰甚至污染检测器。那么,该如何设定检测器的温度呢?

      (2) 分析原因 在气相色谱分析中,检测器温度的设定有以下两点原则:

      ①要满足检测器灵敏度的要求;

      ②要保证流出色谱柱的组分在检测器内不冷凝。

      检测器温度设定太高,如提高FID的温度会增大响应和噪声,而提高TCD和FPD的温度则灵敏度降低,通常设定温度为250℃左右即可。

      ECD的操作温度一般要高一些,常用温度范围为250~300℃。无论色谱柱温度多么低,ECD温度均不应低于250℃。这是因为温度低时,检测器很难平衡。

      热离子源的温度变化对NPD灵敏度的影响极大,温度高,灵敏度就高,一般设定300℃左右,在该温度下检测器灵敏度和稳定程度都比较好。

      (3) 解决方案

      ①检测器温度一般高于柱终温30℃,或等于汽化温度,以避免色谱柱流出物在检测器中冷凝污染检测器。

      对于FID,首先保证样品在FID内不冷凝,才能进行检测;其次,FID温度不可低于1。0℃,以免水蒸气在检测器冷凝,导致检测器内电绝缘下降,引起噪声骤增;所以FID停机时必须在100℃以上灭火(通常是先停H2,后停FID的加热电流),这是FID使用时必须严格遵守的操作。

      ②应注意不同检测器的温度要求区别。

      FID的温度一般设定在200℃以上。

      TCD的灵敏度与热丝和池体间的温差成正比,显然增大其温差有两个途径:一是提高桥流,以提高热丝温度;二是降低检测器池体温度。这决定于被分析样品的沸点。检测器池体温度不能低于样品沸点,以免样品组分在检测器内冷凝,因此对于某些样品由于其沸点的限制,采用降低温度法提高灵敏度是有限的,而对于气体样品,特别是永久性气体,此法可取得良好的效果。

      对于FPD,基于其检测原理,硫、磷的光谱发射需要一定的温度条件,一般讲温度低一些有利于提高样品的灵敏度,但是对于双火焰的FPD,温度影响比单火焰小得多,而双火焰FPD中温度对硫和磷的响应都有影响,且规律复杂。因此,为防止湿气与污染物的干扰,FPD在整个色谱系统中温度最高,通常比柱温高50℃以上。

      而ECD温度对基流和峰高有很大的影响,而且样品不同在ECD上的电子捕获机理也不一样,受检测室温度的影响也不同。所以要具体的情况具体分析。

      (4) 案例分析 利用Agilent 6890N气相色谱仪分析甲基环己烷(沸点100℃)和环己烷(80℃)的混合物,因组分沸点较低,选择柱温60℃,FID温度200℃,两组分均能在短时间内流出(t环己烷=1.6min、t甲基环己烷=2.3min),分离度R=3.7达到要求。

      检测器温度的设定还需要具体情况具体分析,例如Agilent 6890N的FPD的最高使用温度是250℃,当进行检测有机磷农药的时候,柱温经常会高于250℃,主要是因为FPD是富氧型的检测器,化合物在检测器内大多被燃烧,而不会污染检测器,因此检测器温度在该情况下可以低于柱温。

      在这个步骤中要选择适当的溶剂,以便有效地活化SPE柱。对于含水样品而言,好的预处理溶剂应该满足以下几个特点:①能与含水样品基质(样品及缓冲溶液)很好地互溶;②容易扩散到SPE填料的小孔内;③可以洗脱填料上的极性及非极性杂质。

      溶剂过少,或者溶剂过柱的流速过快都可能造成萃取柱未能充分活化。流速过快会导致碳链未能充分伸展开,另外,还可能在填料中形成沟渠效应,沟渠效应不利于有效萃取,因为这种效应会降低吸附剂与样品接触的表面积,导致吸附剂容量的明显下降。在样品过柱时,部分样品进人这些沟渠快速通过SPE柱,未能充分地与吸附剂接触,其结果是回收率降低。一般流速在0.5~3.0 mL/min是不会对SPE填料造成沟渠效应的。对于许多SPE柱,特别是以硅胶为基质的SPE柱,预处理好的柱子在添加样品之前应该保持湿润。万一在样品过柱之前SPE柱填料中的溶剂已经流干,最简单的方法就是重新对该SPE柱进行预处理,然后再进行下面的步骤。但是,如果填料已经形成了沟渠,重新预处理步骤并不能解决问题。这时,最好就是放弃已形成沟渠的柱子,因为用这种柱子得到的回收率和重珊陛都不会好。

      沟渠效应在薄膜型的SPE柱上表现不明显。因为这种SPE柱的柱床较浅,框架较为刚硬,即便在高流速下也不易产生沟渠效应。薄膜型SPE柱的这种特性使其较为适用于大体积样品的快速过柱。例如,在对环境水的检测中经常需要处理的水样体积为升级的,采用这种萃取材料可以大大地减少样品前处理的时间。薄膜型萃取柱也广泛应用于药物分析,因为可以减少溶剂的用量。

      在SPE柱预处理的步骤中,调节萃取环境的pH和离子强度对于目标化合物从样品基质中转移到萃取吸附剂上也十分重要。萃取环境的pH和离子强度调节的不正确,会直接影响目标化合物在吸附剂上的保留。pH对于可离子化的化合物的状态影响很大,如果环境的pH不合适,目标化合物将无法被定量地保留在SPE柱上。通常SPE柱预处理的pH应该与样品的pH相同。

      样品通过SPE柱时,目标化合物能否被有效地保留,取决于萃取的化学及物理条件。如果目标化合物依然与样品基质组分键合,就无法被SPE柱的填料保留,而是随着样品基质一起流过SPE柱,也就是柱穿透。这样势必导致回收率降低。在样品过柱过程中,最常见的柱穿透问题的产生往往是由流速超过目标化合物与吸附剂之间的亲和力所引起的。流速过快会导致目标化合物与吸附剂的键合位置之间的传质过程不能充分地进行。

      因此,在出现回收率偏低时,需要考虑的问题之一就是样品过柱的流速是否适当。除此之外,可能造成柱穿透的因素还包括:①固相萃取柱预处理的条件不合适;②加入不合适的溶剂(离子强度,有机强度等);③体积超载,保留弱的目标化合物随基质流失;④质量超载,柱容量不够(目标化合物+基质);⑤萃取填料不适合目标化合。

      我们已经讨论了SPE柱预处理和基质影响的问题。流速对于样品过柱步骤的影响是很大的,必须保证样品能够与吸附剂充分地接触。过快的流速会导致柱穿透。如果目标化合物在萃取柱上的保留很弱,就可能随样品基质流过SPE柱。另外,还可能在接下来的洗涤步骤中被洗涤液洗脱,流出SPE柱,造成目标化合物进一步的流失。

      在这种情况下,即便是微小的化学变化(例如,溶剂的变化)或流速的变化都会对重现性产生影响。对于以离子交换为机理的萃取,样品过柱的流速就更应该注意。因为离子交换的键合动力学表明其所需的键合速度比反相键合要慢。必须指出的是,样品过柱的流速并非越慢越好,流速过慢可能会使样品基质中的其他成分被保留,从而导致干扰物增加,回收率降低,甚至影响最后的分析。

      由体积超载或质量超载引起的柱穿透问题可以通过减少样品用量或增加吸附剂用量得以解决。在许多情况中,质量超载往往是由样品基质中的非目标化合物的保留而引起的。因此,选择恰当的萃取机理是解决这个问题的较好途径。

      例如,对于一个可以离子化的目标化合物而言,如果主要干扰物是非极性的,就应该避免采用C8、C18等非极性机理的吸附剂。而应该根据目标化合物的pKa选用适当的离子交换SPE柱或混合型萃取柱。也可以采用两种不同萃取机理的萃取柱叠加的方式,用上面一根柱来吸附杂质,下面一根柱来吸附目标化合物。例如,在萃取生物样品中盐酸克伦特罗时,就可以将C18柱和阳离子交换柱串联在一起,C18柱用于吸附样品中的非极性和中等极性的杂质,阳离子交换柱用于吸附盐酸克伦特罗,最后只对阳离子交换进行洗脱。

      固相萃取柱洗涤

      这个步骤中目标化合物流失主要有两个原因。一个原因是上面提到的目标化合物在萃取柱上的保留不够强,当进行洗涤时,部分目标化合物随洗涤液流出萃取柱。另一个原因是所选用的洗涤溶剂对目标化合物的洗脱能力太强,在洗涤干扰物的同时也洗脱了目标化合物。这时,应该更换洗脱强度较弱的洗涤溶剂。流速的影响在这个步骤的表现不明显,无需作为重点去考虑。

      固相萃取柱干燥

      柱干燥的目的是除去残留的水分及水溶性干扰物。视填料的多少,干燥时间也有所不同。一般在真空或加压的条件下3~5 min的干燥时间就足够了。在真空干燥时,判断是否干燥有一个简易的方法,就是用手接触接近柱床的位置,如果感觉温度比室温低就表明还有水分。

      注意,过分的干燥也可能造成目标化合物的流失,特别是在一些反相固相萃取中。疏水键合取决于填料烷烃链与目标化合物问的H-C作用力,如果填料过分干燥到除溶剂点,目标化合物就会受到物理环境的限制,以致洗脱溶剂无法将其从填料的键合位置释放出来。另外,还要注意的是过分干燥可能会引起易挥发化合物的部分流失。

      在对目标化合物洗脱时,我们希望能够用最少的溶剂有选择性地对目标化合物进行完全的洗脱。洗脱溶液体积小一方面可以增加选择性;另一方面可以缩短或省略样品浓缩的步骤。洗脱溶剂的洗脱强度应该是以能够完全破坏目标化合物与填料之间的键合为基准。过强的洗脱溶剂会增加馏分中的杂质含量。流速的控制在目标化合物洗脱步骤中也十分重要,必须保证有足够的时间让洗脱溶剂与目标化合物进行作用,将目标化合物从吸附剂的功能团中释放出来。

      必须注意洗脱条件是否恰当,例如pH、极性、溶解度等。如果采用的是离子交换,就必须注意2个pH单位的原则,在阳离子交换中经常使用氨水来调节洗脱溶剂的pH。由于氨水在空气中容易挥发,使得洗脱溶剂的pH降低。因此,应该每天配置新鲜的氨水洗脱液。

     

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