倒置荧光显微镜原理

　　倒置荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或紫蓝光420nm）作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是检验的重要仪器之一。

　　倒置荧光显微镜

　　细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不 能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，倒置荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一，已有100多年历史。近年来，由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用， FISH、绿色荧光蛋白（GFP）技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广，显微照相、数字CCD成像技术的辅助驱动，赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。

　　倒置荧光显微镜和普通显微镜区别

　　倒置荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外，基于荧光的特性，还具备以下独特的功能要求:

　　(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。

　　(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片，从光源中选择合适的激发光谱，使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合，以期望获得最大的荧光。

　　(3)为获得较弱的荧光图像，还要建立一套截止滤色片，它使所需观察的荧光进入系统成像，而将其余的光波，包括发射光阻挡在外，用来提高图像的衬度。

　　(4)放大的光学系统应适应荧光的特性，最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度 的荧光图像。

　　(5)仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸，保证电器安全。

　　(6)照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。

　　(7)光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。

　　倒置荧光显微镜原理及结构特点

　　在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。倒置荧光显微镜的基本构 造是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等）的基础上组成的。

　　荧光光源

　　倒置荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或紫蓝光420nm）作为激发光。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。常用的光源有超高压汞灯或发光二极管。

　　激发滤片

　　荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断（或压制）滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。

　　分类

　　倒置荧光显微镜就其光路来分有两种：

　　1）透射式倒置荧光显微镜

　　激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的倒置荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。

　　透射式倒置荧光显微镜的原理

　　2）落射式倒置荧光显微镜

　　这是近代发展起来的新式倒置荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种倒置荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。缺点在用低倍率物镜时，像比较暗因此必须用大数值孔径的物镜，滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。