利用细胞计数板测定血细胞数量及大小

　　细胞计数是细胞培养 中常用的技术，通过细胞计数可以知晓细胞的生长状态，绘制细胞生长曲线。细胞计数板是常用细胞计数的器材，具体实验步骤如下：

　　一、 目的与要求

　　1. 掌握用血球计数板进行细胞直接镜检计数的方法。

　　2. 学习测量细胞大小的方法。

　　二、 实验原理

　　动物组织细胞的体外培养、血液中血细胞数量的变动、许多产品的细菌 学检查、微生物培养等科研、生产和临床上常常需要检测细胞的数量。测定细胞数量的方法有很多种，其中，用血细胞计数板于显微镜下直接计数的方法样品用量少，操作简便、快速、直观，是一种较常用的细胞计数方法。

　　血细胞计数板由一块长约7.5cm、宽3.5cm的厚玻璃制成，在中部1/3面积处有4条槽，内侧两条槽之间还有1条横槽相通，在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片平面低0.1mm。平台中部各有一个计数室，每个计数室分九大格，每格边长1mm，面积为1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格被划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板及组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微生物 细胞的计数。

　　细胞的大小和形态依细胞种类不同各异，通常血细胞呈椭圆形或圆球形，直径在10?m左右，按公式V=4/3?ab2(a为长半径，b为短半径)可求出细胞体积。因此，测量细胞体积首先要用测微尺测出细胞的长半径和短半径。

　　常用的测微尺有目镜测微尺和物镜测微尺两种。目镜测微尺为一块圆形的薄玻璃片，直径20-21mm，正好能放入目镜的镜筒内，其上面刻有不同形式的标尺。标尺有直线式和网格式两种，直线式又分为“十”字形和“一”字形两种。直线式测微尺总长10mm，分为10大格，其上有数字指示，每一大格又分10小格，共100小格。网格式测微尺常用来测量面积或计数。

　　物镜测微尺是一种特制的载玻片，其中央有一个圆圈，圈内具有一个有刻度的标尺，为直线式标尺，全长1mm，分为10大格，每大格又分10小格，共100小格。每小格长度为0.01mm，即10?m。

　　由于目镜测微尺刻度的长度随物镜放大倍数不同而有改变，所以用目镜测微尺测量细胞前，首先要测定目镜测微尺的长度，即使用物镜测微尺来确定目镜测微尺刻度的长度，然后再以目镜测微尺上的刻度作为测量细胞时的度量单位。

　　三、 材料和用具

　　显微镜、载玻片、盖玻片、血球计数板、采血针、干消毒棉球、移液器、试管、滴管、目镜测微尺、物镜测微尺、计数器。

　　75%乙醇、红细胞稀释液、白细胞稀释液。

　　四、 操作与观察

　　(一) 血细胞计数

　　1. 用1mL移液器准确吸取0.38mL白细胞稀释液放入一支干净的小试管内，加塞备用。用5mL移液器准确吸取3.98mL红细胞稀释液，放入一支干净的中试管内，加塞备用。

　　2. 用消毒棉球蘸75%乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘，待酒精挥发后用采血针刺入皮肤2-3mm深，让血液自然流出。(注意：必须待酒精挥发后用才能采血，否则流出的血液不成滴，无法吸取。)用干消毒棉球拭去第1滴血液，待第2滴血液成大滴时，用移液器吸20?l血,再将移液器内的血趁出血处尚有血液流出，换1个枪头用移液器吸取20?l血液放入盛有红细胞稀释液的试管底部。轻轻摇振试管1-2min，混匀稀释的血液，但不可用力过猛，以免产生泡沫。

　　3. 充液：用擦镜纸将计数板擦干净，盖上盖玻片。用移液器吸取20?l稀释的血液，滴在计数板上盖玻片的边缘，使其依靠毛细现象自动流入计数室内。一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡，应洗净计数板和盖玻片，干燥后重新充液。红细胞和白细胞应分两次充液。

　　4. 计数：为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序，对正好压在格线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。如果计数白细胞时发现各大方格的白细胞相差8个以上或计数红细胞时发现各中方格的红细胞相差20个以上，表明血细胞分布不均匀，须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计数。

　　5. 计算：

　　(1)白细胞数：将四角的四个大方格内数得的白细胞总数乘以50，即得每立方毫米血液内的白细胞总数。为什么?

　　(2)红细胞数：将中央大方格的四角和中央共五个中方格内数得的红细胞总数乘以10000，即得每立方毫米血液内的红细胞总数。为什么?

　　(3)按目前临床上血细胞计数采用的通用单位，将以上结果换算为每升血液中各种血细胞的数量。

　　(二) 血细胞大小的测量

　　1.安装与校尺

　　(1)将物镜测微尺置于显微镜下(刻度面朝上)，用低倍镜观察，慢慢调焦，找到物镜测微尺刻度。

　　(2)取下目镜，旋下目镜上盖，将圆形目镜测微尺放入镜筒中，旋上目镜盖后把目镜放回镜筒内。

　　(3)观察并调整目镜测微尺与物镜测微尺的位置，使两尺平行，找出两尺刻度完全重合的两个位置，记录并按下式计算：

　　例如，重合两处之间目镜测微尺有50小格而物镜测微尺有68小格，则目镜测微尺每格长度为68/50×10=13.6m。

　　(4)以同法用其它物镜测定目镜测微尺每格的长度。

　　2. 测量细胞体积：取下物镜测微尺放入保护盒内，换上血涂片，用目镜测微尺测量红细胞和白细胞的长度与宽度，取其一半为长半径和短半径，代入公式求体积。测量完毕后小心取下目镜测微尺，包装后放回盒内。

　　3. 计算：V=4/3?ab2(a为长半径，b为短半径)。如果血细胞是圆球形，其体积V=4/3?R3(R为半径)。为减少误差，同一标本需测5个细胞的数据，取其平均值计算体积。

　　注意事项：测量细胞大小的时候，不影响更换物镜观察，如果需要更换物镜则进行测量细胞大小，则需要重新校准物镜。