醋酸膜蛋白电泳仪：影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳操作因素探讨

　　导读：影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳操作因素探讨，摘要:本文结合人体血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理以及多年来在实验教学中的经验总结,，环节作了分析探讨,找出影响蛋白质区带分离清晰的主要因素和解决方法,提高区带的分辨，关键词:血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验操作中图分类号:Q51文献标识码:A，人体血清蛋白的组成可分为:A—白蛋白,G—球蛋白(其中包括:α1球蛋白,α2球蛋，正常人血清中各种蛋白质的含量有其正

　　摘　要:本文结合人体血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理以及多年来在实验教学中的经验总结,对电泳实验操作中的主要

　　环节作了分析探讨,找出影响蛋白质区带分离清晰的主要因素和解决方法,提高区带的分辨力和实验结果的准确性,充分体现醋酸纤维薄膜电泳在血清蛋白组成成份分析中应用的优越性。

　　1　概　述

　　人体血清蛋白的组成可分为:A—白蛋白,G—球蛋白(其中包括:α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白和γ球蛋白)。正常人血清中各种蛋白质的含量有其正常值范围,血清中白蛋白与球蛋白的百分比A/G值大于1,而异常人血清的A/G值小于1。有关统计数据见下表:

　　正常人体与异常人体血清中各种蛋白质的百分含量表

　　人体血清各蛋白质

　　白蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A/G值

　　正常人血清组成54.0%—73.0%2.8%—5.1%6.3%—10.6%5.2%—11.0.5%—20.0%

　　>1

　　肝硬化患者血清组成

　　<50%2%—5%4%—9%6.5%—122%—48%

　　<1

　　肾病患者血清组成

　　<50%2%—5%明显升高明显升高12%—20%

　　<1

　　从表中的统计数据可知测定血清蛋白的A/G值在医学临床诊断上具有十分重要的意义。而醋酸纤维薄膜电泳能快速、准确地测定出人体血清蛋白的A/G值,且该方法具有操作简单,对样品需求量少,区带清晰,

　　收稿日期:2000-06-12

　　作者简介:徐文俊(1966—　),实验师,从事生物化学及微生物学的实验教学工作.

　　徐文俊　影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳操作的因素探讨·33·

　　定量分析时灵敏度高,同时还便于照相和保存等特点。因此近年来在医学临床化验中得到广泛采用。

　　然而,在实际的应用中由于影响其操作的因素甚多,常常导致薄膜上各条蛋白质区带分离不清晰,或蛋白质分离不完全,直接影响对血清蛋白的定量分析结果的准确性。本文针对这一问题结合其原理及主要操作环节进行分析。

　　2　操作原理

　　采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法,叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。醋酸纤维素薄膜具有泡沫状的结构,有强的渗透性,对于膜上运动的分子无阻力,其厚度仅为120微米。

　　人体血清经点样器点样于薄膜的一端,然后将其放于电泳槽的两极之间,由于人体血清各蛋白质的等电点均低于pH=7,因此在pH=8.6的缓冲溶液中电泳时,它们均电离成阴离子。所以将点样端置于电泳槽的负极端后,接通电源,在电场力的作用下,它们都会由负极向阳极移动。又由于各种血清蛋白的等电点不相同,在同一pH值下进行电泳时,它们所带的电荷量则不相等,同时各种蛋白质还存在分子量的大小差异,最终导致它们在电场中移动的速度不同。蛋白质分子量小,而所带电荷数多,则移动速度快;反之亦然。因此,利用蛋白质的这一性质,可以对人体血清的各种蛋白质进行分离。分离出的蛋白质经过氨基黑染色,漂洗后便可在薄膜上形成各条蛋白质的染色区域色带,再根据这些色带的颜色深浅,染色区域的大小,经比色后可以定性或定量测定各蛋白带的含量。

　　3　影响因素分析

　　3.1　血液样品处理方式的影响

　　电泳使用的血液样品必须确保新鲜,不能发生溶血反应。从患者身上采集的血液样品应即时分离出血清,以避免出现溶血现象。为了尽快分离出血清,常常采用的方法是迅速地将采集到的血液样品采取离心分离,同时分离出的血清应尽快进行电泳,以避免血清蛋白变性沉淀或被微生物污染。

　　3.2　醋酸纤维薄膜的选择的影响

　　醋酸纤维素薄膜具有泡沫状的结构,薄膜的质地好坏将直接影响血清蛋白在薄膜上的分离。而薄膜在生产,加工、包装、运输、裁剪等过程中常常会导致薄膜表面受损,影响其质地均匀。因此,在电泳前必须对其进行检测。检测方法是将薄膜小心地放入盛有缓冲溶液的培养皿中,使它漂浮于液面上。若迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则表明薄膜质地均匀;若薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等,则为厚薄不均匀的薄膜。检测时应选用质地均匀的薄膜。薄膜厚薄不匀会造成区带歪扭不齐,各区带界限不清,背景脱色困难,实验结果难于重复等现象。

　　3.3　缓冲溶液电场强度的影响

　　电场强度对泳运速度起着十分重要的作用,而泳动速度快慢又影响着电泳分离效果。电场强度越高,带电质点移动速度越快,电泳分离时间越短,分离效果越差;反之亦然。因此对于不同的物质进行电泳分离时,为了在最短时间内取得最清晰的分离效果,应考虑电场强度这一影响因素。通过大量实践证实:对于血清蛋白等大分子物质进行醋酸纤维薄膜电泳分离的最佳电场强度为1.0～1.5伏特/毫米。

　　3.4　缓冲溶液的离子强度影响

　　离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力,即全部的离子效应,它取决于离子电荷的总数,而与缓冲溶液中盐类的性质无关。缓冲溶液的离子强度越高,带电质点的泳运速度越慢;离子强度越低,带电质点·34·成都大学学报(自然科学版)

　　的速度越快。对于电泳分离的最佳离子强度应控制在0.02～0.2范围之间,而醋酸纤维薄膜电泳分离的最佳离子强度为0.07。

　　3.5　缓冲溶液的酸碱度影响

　　缓冲溶液的pH决定带电质点解离程度,也决定了物质质点所带净电荷的多少。血清蛋白是两性电解质,pH值距等电点越远,质点所带电荷越多,泳运速度越快;反之,则越慢。在一定的pH值(常用缓冲溶液来维持其pH值)条件下,被分离的质点所带电荷差量越大,质点分离越容易,分离效果越好。因此,当分离某一蛋白质混合物(如血清蛋白)时,应选择一个合适的pH值,使各种蛋白质所带净电荷的量差异较大,以利于分离。由于人体血清各蛋白质的等电点均低于pH值,通过大量实践证实:在pH=8.6的缓冲溶液中电泳时,它们不仅均电离成阴离子,在电场力的作用下,它们都会由负极向阳极移动,同时,它们各自所带的电荷量差异最大,最能适宜分离。

　　3.6　血清点样操作影响

　　醋酸纤维薄膜有光泽面与无光泽面之别。无光泽面才是点样面,操作时必须认真加以区别,若点样误点在光面上,则不可能进行电泳分离。同时,操作时还需要注意点样的正确操作方式。点样时,先用血色素吸管将2～3微升的血清均匀地涂在点样器表面,再用点样器“印”在薄膜的点样区内。

　　操作时,尤其应注意薄膜上的点样线必须用两张厚型的载玻片架空后,才能进行点样。点样时,点样器必须与薄膜保持垂直。有关点样位置请参照图1。

　　图1　醋酸纤维素薄膜规格及血清点样位置图

　　3.7　电泳仪的使用操作影响

　　电泳仪操作不当对电泳分离影响甚大。电泳仪与电泳槽的各电极的连接必须正确无误。并且必须将点样面向下,在pH值为8.6的缓冲溶液中电泳分离血清蛋白时,点样端置于电泳槽负极,薄膜两端必须紧贴作盐桥的三层滤纸,确保导电性能良好。电泳仪的电流强度及电压大小设置必须根据电泳物质性质来确定。

　　3.8　薄膜染色,漂洗的操作影响

　　电泳结束后,应将薄膜立即进行染色固定。薄膜必须一张一张地投入到10B的氨基黑染液中,染色固定前薄膜与薄膜之间一定不能重叠,否则,因薄膜上血清蛋白还未固定,彼此粘链,严重影响其分离效果。

　　薄膜染色后的漂洗对于被分离物质最终能否清晰地呈现于薄膜上起着关键性的决定作用。漂洗的目的在于将其背景颜色充分脱去,且使被分离后染色物质能够清晰地呈现出来。

　　因此,在实际操作中必须注意控制薄膜的染色,漂洗时间和程度,防止被分离物质的染色区带颜色太浅而背景脱色不够,颜色过深,这会严重影响物质的分离清晰度。对于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离,染色时间通常为5分钟,连续漂洗次数通常4～5次,每次漂洗时间通常10～15分钟。徐文俊　影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳操作的因素探讨·35·

　　4　小　结

　　综上所述,影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离效果的因素是多方面的。因此,在医学临床应用或实验操作中,要使分离得到的电泳图谱清晰,测定的血清蛋白组成的百分含量准确,必须综合上述诸多因素全面分析,选择最佳操作条件和操作方法。

　　由于醋酸纤维薄膜电泳具有操作简单,对样品需求量少,区带清晰,定量分析时灵敏度高,同时还便于照相和保存等特点,因此在生化科研工作中应用非常广,且分离原理及操作方式相似,所以本文总结出的方法也有助于提高醋酸纤维薄膜电泳技术在血红蛋白、球蛋白、甲胎蛋白、类固醇,同功酶等科学实验及生化产品分析中结果的准确性。