WEALTEC垂直电泳仪的使用方法

　　本实验的目的是学习WEALTEC垂直电泳仪基本操作流程，确保垂直电泳仪正常运行。主要内容如下：灌胶、染色与脱色注意事项，详细方法如下：

　　一、 灌胶

　　1. 把制胶器放在平稳的台面上。

　　2. 保持制胶器干燥，抬起两侧的羽状开关放开卡门，平放，放进橡胶垫圈并紧扣。先把厚玻璃平板放入，再放两侧的垫片，后放入带凹型的玻璃平板。

　　3. 紧紧合上卡门，同时按压两侧的羽状开关听到“咔嚓”声音。

　　4. 倒分离胶：将配好的分离胶溶液用加样枪缓慢加入制胶玻板之间,直至液面达到卡门边框下缘线处。小心用加样枪将去离子水沿水平方向加入制胶板中的分离胶液面上，以防止胶液蒸发并保证胶面平整。聚合大约需要30mins。

　　5. 倒浓缩胶：分离胶聚合后，倒掉去离子水，用滤纸吸去残液。在玻板中加满浓缩胶溶液，轻轻地插入合适的梳子，梳子的厚面向实验者，避免产生气泡。

　　30分钟后，除去梳子，抬起两侧的羽状开关放开卡门，拿出带胶的制胶玻板。

　　6. 安装电泳槽：按压电泳槽中央夹具的开关使卡门松开，将玻璃夹板放入槽内。注意，两玻璃夹板的凹玻板均应与电泳槽内芯接触。如果每次只电泳一块胶，另一套玻璃夹板必须用提供的有机玻璃板代替。

　　7. 样品处理：在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入上样buffer，在100℃加热3-5分钟以使蛋白质变性。

　　8. 加样：在外水槽加电泳缓冲液至槽体的一半位置。放正槽体，继续加注缓冲液，避免产生气泡，使内槽的水位均超过凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加样器或普通加样枪在梳井内按预定顺序加样，加样量通常为10～25μl。

　　9. 电泳：盖好上盖，在100—150V的电压下电1—2小时，一般浓缩胶电压80V20~30Min，分离胶120V80Min，到样品指示剂到达玻璃板的下缘，关掉电源。取下玻璃夹板。用刀片或薄板将胶板玻璃橇开，用单面剃刀片将分离胶切掉，将凝胶板的左上角切掉一小角以标记样品顺序。

　　附录

　　染色与脱色(考马斯亮蓝法)

　　1. 如上所述，将电泳好的凝胶板取出。手戴橡胶手套将凝胶小心移入染色器皿中。

　　2. 在染色皿中加入100ml考马斯亮蓝染液(含0﹒25﹪考马氏亮蓝R-250，45﹪甲醇，10﹪冰醋酸的水溶液)，加盖，在摇床上染色2小时。

　　3. 将染液倒回贮存瓶，反复使用。在染色皿中加入100ml脱色液(10﹪冰醋酸，45﹪甲醇)，振荡脱色3小时，也可反复更换脱色液，缩短时间。

　　胶的保存

　　用30﹪甲醇，7﹪乙酸，2-5﹪甘油混合液振荡处理1小时。

　　注意

　　1. 清洗玻璃板。玻璃板应清洗干净，玻璃表面的油污会造成分离胶与浓缩胶界面的不平整。经用去污剂洗涤后的玻璃板先用蒸馏水冲洗，再用纱布蘸乙醇擦拭玻璃表面。

　　2. 分离胶浓度的选择。低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好：高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。

　　3. TEMED的加入量。TEMED是促进丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂，可适当多加。事实上，配制分离胶时每块胶板按2滴加入，效果也不错。

　　4. 电极缓冲液的配制。电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶，可考虑配制5X浓度的浓缩液。方法如下：将144g甘氨酸和30﹒2gTris溶于1升蒸馏水中。使用时稀释5倍。

　　5. 丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。但在形成凝胶后则无毒。操作时应戴橡胶或塑料手套，尽量避免接触皮肤，并注意实验后洗手。

　　电转印：

　　正极(在下方，红色电极) 两层滤纸 NC膜或PVDF膜 PAGE

　　胶 两层滤纸 负极(在上方，黑色电极)

　　定电压：10V, 40~60Min

　　注意：NC膜要放在正极，要用手或滚子压走气泡。

　　转印完毕，将NC膜取出，室温干燥30-60min，浸入1%BSA的PBS液中4℃过夜封闭。

　　2) 酶免疫染色

　　① 取出封闭液中NC膜，含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次。

　　加入1：400的抗CD59McAb10ml，37℃1h。

　　② 含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次

　　③ 加入1：4000的羊抗鼠IgG10ml，37℃1h。

　　④ 含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次

　　⑤ 加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,显色20-30min。

　　观察条带情况，判断结果。

　　电泳槽一般可分为三类即：水平电泳槽，主要是进行核酸分子的琼脂糖凝胶电泳;垂直电泳槽可以在小批量核酸电泳和蛋白电泳中使用;转移电泳槽主要是进行蛋白样品转移的电泳仪。