多酚氧化酶(PPO)的活力检测与纯化

　　很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。反应如下：

　　多酚氧化酶(po1yphenoloxidase，PP0)是一种含铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致。

　　一、试剂

　　0.025mol/L磷酸钾缓冲液( pH7.2);0.15mol/L儿茶酚溶液;10mmol/LTris-HCl溶

　　液(pH8.3);硫酸铵。

　　二、材料

　　梨

　　三、器材

　　组织匀浆机，漏斗，滤纸，分光光度计。

　　四、操作方法

　　(1)多酚氧化酶(PP0)的提取

　　1. 丙酮粉制备：取果肉组织100 g，加入200mL冰丙酮(—20℃左右)，用高速组织捣碎机匀浆5min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。

　　2.酶液制备：称取1g丙酮粉，加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液( pH7.2)，0℃下用磁力搅拌器匀浆30min，在12 000rpm下离心30min，取上清液，得粗酶提取液。

　　(2)多酚氧化酶(PP0)的纯化

　　向上述酶液中加入NH4SO4至为80%饱和溶液， 搅拌30min, 过夜，于12 000g离心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中(pH7.2), 对10mmol/LTris-HCl溶液(pH8.3)透析18h, 期间更换三次，即为纯化多酚氧化酶。

　　(3)多酚氧化酶(PP0)活力的测定

　　以儿茶酚为底物，在1cm的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中(pH7.2)， 0.1mL 0.15mol/L儿茶酚溶液，混匀，室温下放置3分钟后，加入0.1mL酶液, 5s后开始扫描1min内A420值的变化，酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。

　　五、注意事项

　　多酚氧化酶易失活，提取酶时宜在低温下进行。