【摘要】：土壤酶是土壤的组成成分之一。土壤酶的活性与土壤物理特性、水热状况、土壤的有机、无机组分的化学组成及吸收性复合体的特征等有着密切的相关性。元蛋白质组学是近年出现的一种基于蛋白质组学对微生物群落进行研究的新技术,其定义为对特定环境混合微生物群落的所有蛋白质进行的即时的、大规模的分析。虽然目前对元蛋白质组学的研究还处在起步阶段,但是它已在特定生境的微生物研究中显现出其强大的功能。本文通过对不同施肥条件下土壤酶活性进行测定,了解胞内和胞外酶的组成；利用密度梯度离心法提取、纯化土壤菌体,超声波破碎获取菌体蛋白,再进行超滤、TCA沉淀等纯化菌体蛋白,通过SDS-PAGE技术分离土壤菌体蛋白；用2D-PAGE技术进一步分离纯化菌体蛋白,获取质量较好的电泳图谱,分析不同处理条件下土壤菌体蛋白的差异性及共同性,利用MS方法鉴定蛋白,通过数据查询与分析比对,解释土壤蛋白质的可能生物来源。
红壤水稻土在不施肥(CK)、施NPK肥(NPK)以及施猪粪肥(M)三种处理条件下,其生物量、理化性质等都发生改变,土壤酶活性也存在着差异。不施肥土样脲酶活性为0.074 mg NH_3-N·g~(-1)土.3h-1,施NPK肥的为0.108 mg NH_3-N·g~(-1)土.3h-1,施猪粪的土样脲酶活性为0.191 mg NH_3-N·g~(-1)土.3h~(-1);不施肥、施NPK肥和施猪粪土样蛋白酶活性分别为2.78μg Tyr·g~(-1)土.48h~(-1),7.55μg Tyr·g~(-1)土.48h~(-1),8.22μg Tyr·g~(-1)土.48h-1；不施肥、施NPK肥和施猪粪土样蔗糖酶活性分别为106 mg Glu·g~(-1)土,1.08 mg Glu·g~(-1)土、1.35 mg Glu·g~(-1)土。对土壤微生物酶活性测定表明：胞内脲酶活性远大于胞外脲酶活性,胞外脲酶活性是CK〈NPK〈CK+灭菌土〈M〈NPK+灭菌土M+灭菌土,同一种土样,加入灭菌土后胞外脲酶活性明显增高；不同的土样,猪粪处理比化肥处理胞内脲酶活性增幅大。胞内脲酶活性是CK〈CK+灭菌土〈NPK〈NPK+灭菌土MM+灭菌土；与胞外酶基本相同,同一种土样,加入灭菌土后胞内脲酶活性也明显增高；不同的土样,猪粪处理比化肥处理脲酶活性增幅大。
实验分别对三种施肥处理的红壤样品,以及每种土样提取的菌体进行平板计数和DAPI计数,计算每克土壤中所含的菌体数量,结果表明DAPI计数要比平板计数高两个数量级。通过密度梯度离心法获取土样菌体蛋白量为：CK土样中提取的微生物总蛋白量最低为0.4μg·g-1土,施NPK肥以及施猪粪肥土样中蛋白含量较高,分别为0.68μg·g-1土,0.78μg·g-1土。通过SDS-PAGE能观察到三种土样的蛋白差异性,蛋白主要集中在44.32 KDa和92.7 KDa之间。
由于样品蛋白提取中,仍有腐植酸类杂质难以去除,二维电泳过程中须选用低盐离子浓度的缓冲液纯化蛋白,采用低温高速离心去除干扰蛋白溶解的一些杂质,选用4℃,12000 r/min离心1h能获得较好的离心效果,进而取得质量较好的电泳图谱。质谱鉴定了三种不同处理土样中的3种共同蛋白,8种差异蛋白。3种共同蛋白分别为假想蛋白FAEPRAM212_02949,噬菌体前头部蛋白酶HK97家族,谷氨酸合酶NADH/NADPH小亚基,8种差异蛋白分别为重组酶A,转录调控因子GntR家族,保守的假想蛋白,类似于AFG1的ATP酶,3-羟基-3-甲基-辅酶A还原酶,外膜蛋白A,Mg相关螯合酶蛋白,其中7号点鉴定结果为混合蛋白：ATP依赖的解旋酶以及双功能酶(乌头酸水合酶,2/2-methylisocitrate脱水酶)。
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