Western具体实验步骤
Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2.电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳
Ig最显着的生物学特点是能够特异性地与相应的抗原结合,如细菌、病毒、寄生虫、某些药物或侵入机体的其他异物。Ig的这种特异性结合抗原特性是由其V区(尤其是V区中的高变区)的空间构成所决定的。Ig的抗原结合点由L链和H链超变区组成,与相应抗原上的表位互补,借助静电力、氢键以及范德华力等次级键相结合,这种结合是可逆的,并受到pH、温度和电解浓度的影响。在某些情况下,由于不同抗原分子上有相同的抗原决定簇,或有相似的抗原决定簇,一种抗体可与两种以上的抗原发生反应,此称为交叉反应(cross reaction)。
抗体分子可有单体、双体和五聚体,因此结合抗原决定簇的数目(结合价)也不相同。Fab段为单价,不能产生凝集反应和沉淀反应。F(ab')2和单体Ig(如IgG、IgD、IgE)为双价。双体分泌型IgA有4价。五聚体IgM理论上应为10价,但实际上由于立体构型的空间位阻,一般只有5个结合点可结合抗原。
发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 当IgG抗体与带有相应抗原的靶细胞结合后,可与有FcγR的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等效应细胞结合,发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcell-mediated cytotoxicity,ADCC)。目前已知。NK细胞发挥ADCC效应主要是通过其膜表面低亲和力FcγRⅢ(CD16)所介导的,IgG不仅起到连接靶细胞和效应细胞的作用,同时还刺激NK细胞合成和分泌肿瘤坏死因子和γ干扰素等细胞因子,并释放颗粒,溶解靶细胞。嗜酸性粒细胞发挥ADCC作用是通过其FcεRⅡ和FcαR介导的,嗜酸性粒细胞可脱颗粒释放碱性蛋白等,在杀伤寄生虫如蠕虫中发挥重要作用。