基因工程常用的工具酶T4 DNA连接酶,以及在谷胱甘肽代谢中起重要作用的γ-谷氨酰转移酶都是非常重要且基础的酶类,它们的表达异常将严重影响生物的生命活动,并且与许多疾病密切相关。本文中,我们利用电化学手段,并且使用金纳米颗粒进行信号放大,分别构建了检测T4 DNA连接酶以及γ-谷氨酰转移酶活性的电化学传感体系。相比于一些传统的酶活性检测方法,本文构建的这两种酶传感器具有高灵敏度、高选择性以及低成本的特点,因此对于医疗诊断有一定的参考价值。
1.T4 DNA连接酶活性的电化学传感器的研究
T4 DNA连接酶是一种基因工程中常用的工具酶,它在DNA复制、损伤修复、基因重组的过程中都起到了十分重要的作用。本章中,我们在金电极表面设计了一种DNA“三明治”结构,在这一结构中,两段DNA分别修饰在金电极和金纳米颗粒表面,在T4 DNA连接酶的催化下,两段DNA发生连接,从而将金纳米颗粒共价连接到金电极表面。由于金纳米颗粒具有很大的比表面积,能够负载大量的电化学信号分子--二茂铁,因而可以起到信号放大的作用。通过获取的二茂铁电化学信号,我们建立了可以检测T4 DNA连接酶活性以及靶DNA点突变的电化学体系,不仅为基因工程提供了便利,而且对于一些疾病的诊断也具有一定的指导意义。
2.γ-谷氨酰转移酶活性的电化学传感器的研究
γ-谷氨酰转移酶是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一,血清中γ-谷氨酰转移酶的活性可作为肝胆疾病相当灵敏的指示剂而应用于临床诊断。在本章中,我们利用γ-谷氨酰转移酶的催化特性,并综合考虑各种氨基酸的电化学性质,设计了该酶的两种反应底物,并使它们在γ-谷氨酰转移酶的催化下进行反应,得到的产物谷氨酰酪氨酸甲酯含有一个自由羧基和一个酪氨酸残基。由于自由羧基可以与预先在金电极表面构建的自由氨基发生缩合反应,从而使得谷氨酰酪氨酸甲酯连接到电极上,又由于酪氨酸残基能够在电极表面被氧化而产生电化学信号,因此,我们构建了一种不需要另外添加电化学探针的γ-谷氨酰转移酶活性检测体系,并有望发展成为肝胆疾病临床检验一种新的技术手段。