免疫荧光单标记和双标记的方法(免疫荧光,双标记,二抗,孵育,一抗)

　　免疫荧光单标记和双标记的方法

　　l免疫荧光单标记方法

　　免疫 荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

　　1)所需材料与试剂

　　(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。

　　(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

　　(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。

　　(4)封闭液。

　　(5)0．01mol／LPBS缓冲液。

　　2)染色方法

　　(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass―bottom培养皿，用0．01MPBS洗2―3遍。

　　(2)加入0．3％的TritonX―100，37℃，30rain。

　　(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

　　(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

　　(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

　　(6)0．3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。

　　(7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。

　　(8)0．3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。

　　(9)90％甘油(PBS配制)封片。

　　(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。

　　2．免疫荧光双标记方法

　　免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。

　　3．样品制备注意事项

　　(1)在进行免疫荧光标记时，如样品的来源为组织，应采用冷冻切片。

　　(2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求。

　　(3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞经荧光染色后可能会产生自发荧光，可用PBS取代一抗作为对照，以区分自发荧光和阳性结果。

　　(4)为了不将细胞压扁，盖玻片与载玻片之间的介质多用甘油与PBS混合液(9：1)封片，甘油还有抗荧光淬灭的作用。同时还应注意封片时避免产生气泡。

　　(5)用指甲油将盖玻片四周封片，注意避免将细胞压扁。

　　(6)为防止荧光淬灭，可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg／mi)，室温，密封可保存6个月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周。