免疫双标二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择

　　免疫双标，抗体如何选择？

　　注意几点：

　　1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。

　　这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。

　　选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。

　　好的抗体真的还是很重要。

　　2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？

　　这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try

　　3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？

　　一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。

　　4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？

　　可以做，过程还可省一步。但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。

　　5）免疫双标荧光的图像如何整合？

　　可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。

　　免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：

　　1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应

　　2. 抗体的选择 一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。

　　3. 封闭液的选择 封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。免疫双标一抗的选择主要有两种形式:

　　第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；

　　对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。

　　第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。

　　对于这种情况，就可以两种一抗一起加了，减少了步骤，避免了很多麻烦。

　　之所以这样做，主要就在于二抗的选择上：

　　对于第一种情况，二抗只能选择抗小鼠的，或者都是抗兔的，如果同时加，就会出现交叉反应，得到不可靠的结果。

　　对于第二种情况，二抗选择就可以分为抗小鼠和抗兔，这样的话，抗小鼠的二抗就只能跟小鼠抗的一抗A结合，抗兔的二抗就只能跟兔抗的一抗B结合了，避免了交叉反应。

　　二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择问题：

　　问题1

　　组织：大鼠

　　一抗：A（小鼠抗大鼠），B（兔抗大鼠）

　　二抗：A（?羊抗小鼠），B（羊抗兔）

　　请问：二抗这样选择是否可行，为什么？

　　回答：这种是最常见的，也是最简单易行的。此时做荧光双标较理想，如二抗A选择羊抗小鼠的Cy2 (绿光), 二抗B选择羊抗兔的Cy3 （红光）。一般来说，此种情况下，两个一抗可以一起孵育，两个二抗也可以一起孵育。

　　封闭液就选择针对二抗的羊血清。一般是用10% normal goat serum 30min 37度。这种情况 选 羊的 或者驴血清 都可以。

　　问题2

　　组织：大鼠

　　一抗：A（小鼠抗大鼠），B（兔抗大鼠）

　　二抗：A（?羊抗小鼠），B（驴抗兔）

　　请问：此时的封闭血清该如何选择？

　　回答：选择BSA，但是BSA也不是万能的，但是不能选择大鼠血清。

　　如果组织变成小鼠，又是什么情况呢？

　　问题3

　　组织：小鼠

　　一抗：A（小鼠抗小鼠），B（兔抗小鼠）

　　二抗：A（?羊抗小鼠），B（羊抗兔）

　　请问：二抗这样选择是否可行，为什么？你是如何理解和处理小鼠抗小鼠的？

　　问题4

　　组织：小鼠

　　一抗：A（小鼠抗小鼠），B（兔抗小鼠）

　　二抗：A（?羊抗小鼠），B（驴抗兔）

　　请问：此时的封闭血清该如何选择？你是如何理解和处理小鼠抗小鼠的？