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  • DNA 甲基化检测技术和MeDIP-qPCR实验数据处理

    文/ 发布于2017-11-20 浏览次数:3034

      检测方法:

      甲基化特异性PCR、Northern印迹法、Western印迹法、免疫细胞化学等,这些检测方法需要花费大量时间,成本高,在临床推广应用时均存在一定的困难。

      高分辨率熔解(High Resolution Melt,HRM)是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的一种新技术,主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析,其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

      作为新一代的遗传扫描工具,HRM具有“简、效、快、廉”等其它技术难以比拟的优势:

      * 简:无需序列特异性探针,不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点;闭管操作,避免交叉污染。

      * 效:最低检测0.1%-0.01%的突变或异常甲基化,检测SNP灵敏度和特异性均为100%。

      * 快:1次同时检测不多于384个样本,在60-90分钟内完成检测。

      * 廉:简化操作步骤、降低人工和试剂成本,费用远少于测序、Taqman探针等方法。

      HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析,是不同于基因芯片检测方法(检测位点多,样本少)的高通量方法。同时,也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。

      1.HRM:

      甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-High Resolution Melting Curve Analyse)是一种不需要 PCR 产物后续操作的,简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现并且可以在一些列的 CpG 位点中检测出单一的一个甲基化的发生,同时,也可以对一系列的 CpG 位点的甲基化水平进行分析。单个 CpG 位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。采用重亚硫酸盐处理 DNA 模板可以使 5-甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在PCR反应前,在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA 链的引物,这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛,一旦这些CpG岛发生甲基化,使胞嘧啶(C)不发生变化,而与未甲基化的胞嘧啶(C)转变成胸腺嘧啶(T),样品中的 GC 含量发生了变化,最终被转化成了熔解曲线 Tm 值之间的差异。 CpG 位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响,因此,根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度。

      HRM方法操作简单、灵敏高、重复性高、成本低、不受检测位点的局限高度等等优势,将对于遗传学、肿瘤学等方面的研究和临床应用提供更大的帮助。

      2.亚硫酸盐测序法(BSP)

      甲基化研究方法的“金标准”,亚硫酸盐法+测序,尽管十分准确,但是费时费力,而且在大多数情况下局限用于小片断(<1kb)。这类方法主要有亚硫酸氢钠-限制性酶切法和methylight(Gene-specific approaches).亚硫酸钠修饰的原理:单链DNA中未甲基化胞嘧啶的第4位氨基,通过磺酸基作用脱氨基,能很易形成鸟嘧啶。5mC虽然也会发生微量脱氨基反应形成胸腺嘧啶,与未甲基化胞嘧啶的脱氨基效率相比,在分析中可以忽略不计。因此,亚硫酸钠修饰反应,可以迅速将甲基化状态的差异转换成碱基差异,使能够在PCR为基础上对各种5mC进行分析,是众多序列特异性甲基化检测方法的基础。

      3.限制性酶切法(combined bisulfite restriction assay, COBRA )

      COBRA 法使用能同时扩增甲基化和非甲基化模板的通用引物PCR扩增经亚硫酸氢钠修饰的DNA样品中感兴趣序列,用限制性内切酶识别序列中包含CpG的酶切位点,例如BstUI识别CGCG,Taq1识别TCGA等。如果该CpG甲基化,不会被亚硫酸氢钠修饰,就对酶切敏感;如果未甲基化,CpG位点被修饰成 TpG,对酶切不敏感。作为完全亚硫酸氢钠修饰的对照,应使用在其识别位点不包含CpG的Hsp 9211 酶(酶切位点为CATG),任何被切的位点表示不完全修饰或非对称甲基化;相反,Tru91可提供完全修饰的阳性对照(酶切位点为TTAA);CCAA不是限制性位点,几乎不被甲基化,完全亚硫酸氢钠修饰应该将它变成TTAA,并被Tru91切割,部分性修饰则没有酶切位点。Hsp9211和Tru91结合, 提供了部分转化或完全转化的阳性对照。COBRA具有简便快捷的特点,但受限于限制性位点,因此不能检测所有的CpG位点。

      4.限制性酶切法(Restriction assay)

      有些限制性内切酶可以区分甲基化和非甲基化序列,比如HpaII和 MspI(切割C^CGG),还有AccII(切割CG^CG)。这些酶对DNA的甲基化状态的敏感,切割甲基化和非甲基化序列的效率不同。酶切之后可以通过qPCR或PCR读取结果,也可以用HELP assay(HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR)进行分析。

      酶切法能达到接近单核苷酸的分辨率,同时又避免了重亚硫酸盐对DNA造成的损害。有些限制性内切酶可以区分甲基化和非甲基化序列,比如HpaII和 MspI(切割C^CGG),还有AccII(切割CG^CG)。这些酶对DNA的甲基化状态的敏感,切割甲基化和非甲基化序列的效率不同。酶切之后可以通过qPCR或PCR读取结果,也可以用HELP assay(HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR)进行分析。酶切法能达到接近单核苷酸的分辨率,同时又避免了重亚硫酸盐对DNA造成的损害。

      5.检测技术-methylight

      methylight是用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)检测甲基化的一种方法。实时定量PCR技术是近几年发展起来的新技术,既保持了PCR 技术灵敏、快速的特点,又具有高通量、重复性、特异性和能够定量初始模板的优点。实时定量PCR 技术是从传统PCR 技术发展而来,其基本原理是相同的,主要不同之处是其定量的体系。PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。

      6.甲基化芯片技术

      7.高通量测序法(MeDIP-Seq)

      MeDIP-Seq(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing)测序是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术,采用甲基化DNA免疫共沉淀技术,通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

      利用MeDIP-Seq技术快速有效地寻找基因组上的甲基化区域,从而比较不同细胞、组织或疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。

      * 精确度高:基因组位点定位精确性可达± 50bp。

      * 可靠性高:直接对甲基化片段进行测序和定量,无交叉反应和背景噪音。

      * 检测范围广:全基因组范围内甲基化区域研究。

      * ?高性价比:通过抗体富集高甲基化区域进行测序,有效降低测序费用。

      MeDIP-Seq生物信息分析:?

      * 1) 基本数据分析:获得原始序列数据(Base calling)、过滤接头。?

      * 2) 序列数据的数据的质量评估(QC):QC图(碱基分布、每个循环的质量)。?

      * 3) 将reads比对到基因组:将预处理reads与reference genome进行mapping,最后得到mapping的sam结果文件,给出mapping结果统计。?

      * 4) Peak 查找:应用sam文件进行peak富集区查找;组间差异Peak筛选;MeDIP-seq数据和表达谱数据结合分析。?

      * 5) Peak长度和染色体分布。?

      * 6) 基因和CpG岛关联:根据找到的peaks的位置信息,确定其关联的基因和CpG岛。?

      * 7) 关联基因GO富集分析:对peaks关联的基因进行GO功能富集分析。

      检测技术-高通量定性分析-靶向测序

      用靶向测序检测DNA甲基化,需要先定向捕获目标序列,进行重亚硫酸盐处理,最后通过二代测序定量目标区域的甲基化位点。

      8.MeDIP-qPCR

      许多研究者都会在亚硫酸氢盐转化之前,先富集甲基化的DNA。这样不仅能够降低背景,也可以节约成本。 ?这两种方法虽然理论上是一样的,但也存在着细微的差异。Anti-methyl抗体能够检测任何甲基化事件,除了传统的哺乳动物CpG甲基化,还有CpA、CpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。但MBD不能识别CpA、CpT二核苷酸中的甲基胞嘧啶。另外,MeDIP抗体只识别单链DNA中的甲基化,而MBD能识别双链DNA。

      MeDIP-qPCR将实时定量PCR技术与MeDIP技术完美结合。首先通过MeDIP技术富集甲基化的DNA片段,然后利用实时定量PCR技术进行检测,最后经过数据分析处理得到检测的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。

      MeDIP-qPCR技术服务流程:

      * A. 将基因组DNA 超声打断成400bp-500bp片段 ;

      * B. 加热变性, 将变性后的单链DNA样品分为两份, 其中一份单链DNA样品加入抗5’-甲基胞嘧啶抗体作为MeDIP样品,另一份作为Input 样品;

      * C. 使用亲和层析分离纯化甲基化DNA片段的抗体复合物(非甲基化DNA片段被洗脱), 纯化得到甲基化DNA片段(MeDNA-IP DNA);

      * D. 实时定量PCR检测.

      MeDIP-qPCR实验数据处理:

      * Total input DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR检测得到Ct (input);

      * MeDNA-IP DNA样品作为模板进行检测得到Ct (IP);

      * 待测基因甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)的效率:(MeDIP / Total input)%=2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100

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