薄层层析TLC通用显色剂

　　薄层层析通用显色剂

　　1通用试剂

　　(1)重络酸钾-硫酸:检查一般有机物.

　　喷洒剂:5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中.

　　薄层检查:喷洒后加热到150℃至班点出现

　　(2)荧光素-溴:检查不饱和化合物

　　喷洒剂:0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中

　　溴试剂:5%的溴的四氯化碳溶液

　　喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.

　　(3)碘:检查一般有机物.

　　方法:a层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合物呈棕色斑点。

　　b层析谱放碘蒸气中5分钟（或喷5％碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷1％淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。

　　(4)硫酸：通用

　　喷洒剂：5％的浓硫酸乙醇溶液，或15％浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸－醋酸（1：1）

　　喷洒后处理：空气中干燥15分钟，再热至110℃直至出现颜色或荧光。

　　(5)硝酸银－氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：检查还原性物质。溶液I:0.1%N硝酸银;溶液II:5N氢氧化铵

　　喷洒剂:I和II以1:5混合(临用前混合)

　　喷洒后处理:105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现.

　　(6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体

　　喷洒剂:5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液

　　喷洒后处理:120℃加热至斑点出现.

　　沉淀试剂:1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性.

　　2生物碱

　　(7)硫酸:检查生物碱及含碘化合物

　　喷洒剂:0.1克硫酸?混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入浓硫酸至澄清.

　　喷洒后处理:110℃加热数分钟至斑点出现.

　　(8)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:检查生物碱及其他含氟化合物.

　　溶液I:0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中

　　溶剂II:8克碘化钾溶于20毫升水中.

　　制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂用.

　　喷洒液:制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得

　　(9).碘化汞钾(Mayer)试剂:检查生物碱.

　　制备液:13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水稀释至1000毫升.

　　喷洒液:制备液加1/10体积的17%盐酸.

　　喷洒后处理:观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.(10)?酸纳-浓硫酸(Mandelin)试剂:检查生物碱.

　　1%>酸纳的浓硫酸溶液.与多种生物碱呈不同颜色.

　　(11)碘－碘化钾(Wagner)试剂:检查生物碱.

　　1克碘及10克碘化钾,溶于50毫升水中,加热,加2毫升醋酸,再用水稀释至100毫升.可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.

　　3酚类,鞣质(12)三氯化铁:检查酚类及酸.

　　喷洒剂:1~5%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液.并加盐酸少许.酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.

　　(13)铁氰化钾-三氯化钾:检查酚类,芳香胺类及还原性物质.

　　喷洒剂:1%铁氰化钾水溶液,2%三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.

　　喷洒后处理:喷洒后酚性物质呈蓝色斑点.再喷2N盐酸,能使颜色加深,纸谱可用稀盐酸洗去喷洒液.

　　(14)4-胺基安替比林-铁氰化钾(Emerson反应):检查酚类.

　　喷洒剂:I.2%4-氨基安替比林乙醇溶液;

　　II.8%铁氰化钾水溶液.

　　或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液

　　方法:先喷洒I,再喷洒II,即显色,或再放入密闭缸中,缸内放25%氢氧化铵,即产生橙色至深红色.

　　(15)对氨基苯磺酸,重氮盐(Pauly试剂):检查酚类,芳香胺类及能偶合的杂环化合物.

　　喷洒剂:4.5克对氨基苯磺酸,加热溶于45毫升12N盐酸中,用水稀释至500毫升,取10毫升稀释液用冰冷却,加10毫升冷4.5%亚硝酸钠水溶液,0℃放15分钟(此试剂于0℃可保存3天),用前加等体积1%碳酸钠水溶液.

　　一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.

　　(16)对甲苯磺酸:检查甾体,黄酮,鞣质.

　　喷洒剂:20%对甲苯磺酸氯仿溶液.

　　喷洒后处理:100℃加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.

　　4含氧杂环及蒽醌类*

　　(17)三氯化铝:检查黄酮体.

　　喷洒1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光

　　(18)碱式醋酸铅:检查黄酮体.

　　喷洒剂:饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液.

　　于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.

　　(19)醋酸镁:检查蒽醌甙,甙元及黄酮体

　　喷洒剂:0.5%醋酸镁甲醇溶液

　　方法:90℃加热5分钟,呈红色至紫色斑点.

　　(20)氢氧化钾:检查香豆素,蒽醌甙及甙元

　　喷洒剂:5~10%氢氧化钾的甲醇溶液.

　　于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点.

　　5萜类,甾体

　　(21)三氯化锑(Carr-Price试剂):检查甾体,萜类,皂类.

　　喷洒剂:25克三氯化锑溶于75克氯仿中(亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液).喷洒后处理:100℃加热5分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.

　　(22)五氯化锑:检查甾体,萜类,皂甙.

　　喷洒剂:五氯化锑-氯仿或四氯化碳(1:4),用前新鲜配制.

　　喷洒后处理:120℃加热至斑点出现,并于紫外线荧光分析灯下检示.

　　(23)香兰醛-硫酸:检查高级醇类,酚类,甾体,萜类,芳香油.

　　喷洒剂:1克香兰素溶于100毫升浓硫酸,或0.5克香兰醛溶于100毫升硫酸-乙醇(4:1)中.

　　喷洒后处理:室温或120℃加热观察显色斑点.

　　(24)4-二甲氨基苯甲醛,醋酸,磷酸(E.P.试剂):检查?Azulene及?前体Proazulene.

　　喷洒剂:0.25克4-二甲氨基苯甲醛,溶于50毫升醋酸5克85％磷酸和20毫升水的混合液中(棕色瓶中保存数月)

　　?:烃室温即成蓝紫色斑点,>前体于80℃加热10分钟出现蓝紫色斑点.

　　(25)氯胺T－三氯醋酸:检查强心甙.

　　喷洒剂:I.3%氯仿T水溶液新鲜制备.

　　II.25%三氯醋酸乙醇溶液(能保存数天).

　　10毫升I加40毫升II,用前混合.

　　喷洒后处理:110℃加热7分钟,紫外线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光.

　　(26)亚硝酸基铁氰化钠-氢氧化钠(Legal试剂):检查不饱和内酯;甲基酮或活性次甲基,常用于强心甙

　　喷洒剂:1克亚硝基铁氰化钠溶于100毫升2N氢氧化钠-乙醇(1:1)的水溶液.显红色或紫色斑点.

　　(27)3,5-二硝基苯甲酸(Legal试剂):检查强心甙,α,β-不饱和内酯.

　　喷洒剂:1克3,5-二硝基苯甲酸溶于50毫升甲醇,加入1N氢氧化钾50毫升.强心甙呈紫红色斑点.

　　6糖类

　　(28)邻苯二甲基苯胺:检查还原糖.

　　喷洒剂:0.93克苯氨,1.66克邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇中.喷洒后处理:105℃加热10分钟.

　　(29)2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchloride(T.T.C.)：检查还原糖及其他还原物质。

　　溶液I：4％（T.T.C.）甲醇溶液；

　　喷洒液：I，II，临用前等体积混合。

　　喷洒后处理：100℃加热5～10分钟，得红色斑点。

　　(30)Keller-Kiliani试剂：检查α－去氧糖，常用于强心甙。

　　试液：100毫升冰醋酸加三氯化铁试液0.5毫升混合均匀.

　　试样1毫克加试液2毫克溶解后,沿试官管壁滴入浓硫酸2毫升,接触面即显棕色,渐变浅绿,蓝色.最后冰醋酸层全部呈蓝色.(31)1,3-二羟基萘-磷酸:检查糖类.

　　喷洒液:0.2%1,3-二羟基萘(Naphthoresorcinol)乙醇溶液100毫升,与10毫升85%磷酸混合.

　　(32)费林溶液(Fehling):检查还原糖.

　　溶液I:69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中.

　　上述二溶液如不清可滤过.临用前等体积混合.溶液II：1N氢氧化钠。

　　7氨基酸

　　(33)茚三酮:检查氨基酸及氨基糖.

　　喷洒剂:0.3克茚三酮溶于100毫升正丁醇,加入3毫升醋酸;或0.2克茚三酮溶于100毫升乙醇(或丙酮中).

　　喷洒后处理:110℃加热至斑点出现.

　　(34)吲哚醌:检查氨基酸和一些肽.

　　喷洒剂:0.2%吲哚醌(Isatin)丙酮溶液,含4%醋酸;或用100毫升1%吲哚醌丙酮溶液加10毫升醋酸.

　　喷洒后处理:100~110℃加热10分钟.

　　(35)1,2-萘醌-4-硫磺酸(Folin试剂):检查氨基酸.

　　喷洒剂:新鲜制备0.02克1,2-萘醌-4-磺酸钠,溶于100毫升5%碳酸钠中.喷洒后处理:室温放于,不同氨基酸出现不同颜色.

　　8有机酸

　　(36)酸碱指示剂:检查有机酸.

　　喷洒剂:0.05%溴酚蓝(或溴甲酚绿,或溴麝香草酚蓝)的乙醇溶液.

　　(37)氧化还原显色剂:检查有机酸.

　　喷洒剂:I.0.075%溴甲酚绿及0.025%溴酚蓝的无水乙醇液.

　　II.0.5%高锰酸钾及1%碳酸钠.10H2O的蒸馏水液.临用前,取I和II按1:1混合后喷酒.

　　喷酒后处理:稳定时间为5~10分钟.对不同的有机酸在纸谱上呈现不同颜色.

　　(38)?(Acridine):检查酸.

　　喷洒剂:0.005%的乙醇溶剂.

　　紫外线分析灯下呈黄色荧光.

　　(39)芳香胺-还原糖:检查酸.

　　喷洒剂:芳香胺(如苯氨5克)和还原糖(如木质糖5克)溶于50%含水乙醇中.喷洒后处理:125~130℃加热出现棕色斑点.

　　氧化苦参碱的提取和鉴定

　　中药苦参是豆科植物苦参(SophorsFlavescensAit)的干燥根,味苦,性寒,有清热燥湿,杀虫等作用.临床上用于治疗痢病,黄胆和皮肤瘙痒症.近年还发现具有抗肿瘤,升白,抗病毒性肝炎等药理作用,苦参中主要含生物碱,此外还有黄铜类成分.

　　一,苦参中主要已知生物碱的结构和性质

　　1.氧化苦参碱（oxymarrine）C12H24N2O2，白色棱晶，易溶于水，甲醇，乙醇，

　　氯仿，不溶于乙醚，苯。溶点：207～208℃（不含结晶水）162～163℃（含一个结晶水）77～78℃（含多个结晶水）结晶水可在145～150℃／0。002mmHg下除去，可于许多金属离子如Fe2＋Cu2+Cr3+等生成沉淀，［α］？？＋47.7℃(乙醇).

　　2.苦参碱(matrine)C15H24N2O在轻石油醚中结晶时，由于温度等条件不同，可以得到αβδ三种结晶（溶点分别为76℃87℃84℃）和一种流体即γ型。通常室温下结晶得到的是α型，易溶于水，甲醇，乙醇，氯仿，溶于苯，在乙醚中溶解度小。［α］？？＋39.11[乙醇]

　　3.脱氢苦参碱(槐果碱)（sophocarpine）C15H24N2O白色棱晶。溶点80～81℃，易溶于甲醇乙醇氯仿，略溶于苯和乙醚，在水中溶解度小。［α］？-29.44(乙醇)

　　4.槐定(sophoridine)C15H24N2O白色棱晶，溶点106～108℃，为苦参碱的一种空间异构体。

　　二．实验目的与要求

　　（1）通过苦参生物碱的提取掌握用渗滤法和离子交换法提取生物碱的方法。

　　（2）掌握沙氏提取器的使用方法。

　　（3）掌握氧化铝吸附薄层层离法和柱层层离法鉴定和分离生物碱的方法。

　　三．原理

　　氧化苦参碱为喹诺里西汀类生物碱，叔胺氮氧化合物与酸成盐溶于水与非生物碱分开，提取的生物碱盐的阳离子部分与H+型树脂发生交换生物碱吸附在柱上，吸附有生物碱的树脂，碱化呈游离生物碱，可被氯仿等有机溶剂提取。

　　R-SO3-Na+＋H+CL-——>R-SO3-H++NaCL

　　SO3Na+H2O

　　生物碱

　　四.实验方法.

　　1酸水提取和离子交换

　　（1）渗漉法

　　取苦参碱400克,加入适量0.5%(g/v)的盐酸湿润后放置一小时，装入渗滤液的PH值及生物碱反应，使渗滤液通过离子交换脂柱，待经过树脂柱的滤液生物碱

　　反应或微弱的反应时，停止交换，将树脂倒入烧杯中，酮蒸馏水洗涤几次，滤干，树脂放入搪瓷盘中自然晾干。

　　（2）浸提法

　　300克？？0.5HCL(g/v)6倍量浸泡48小时，浸出浸液，。。在处理1～2次，2次浸液全体合并。

　　2总生物碱的洗脱

　　将晾干的树脂放入烧杯中，加14％氨水，搅匀，使温度适宜（树脂充分膨胀，但又无过剩的水）约用氨水30～60毫升，静置20分钟后，装入沙氏提取器中，用400毫升95％的乙醇回流洗脱4～5小时（或用氯仿回流提取5～8小时）回收溶剂至干，所得浸膏用70～80毫升氯仿溶解，并转入分液漏斗，充分静置后，弃掉上层油状物，过滤氯酚溶液后用无水硫酸钠干燥，回收氯仿至干，残留物用2～3倍量丙酮处理，即析出固体粉末，放置，过滤，得生物碱粗品，丙酮重结晶一次得浅黄色产品。

　　3苦参生物碱的氧化铝薄层鉴定。

　　样品：氧化苦参碱标准品，粗品，母液

　　溶剂系统：氯仿：甲醇＝19：1（二次展开）

　　石油醚：乙醚：甲醇＝9：9：1

　　显色剂：改良碘化铋钾（改良Dragendorff）

　　4氧化苦参碱的分离与纯制

　　（1）取0.2克氧化苦参碱粗品用少量氧化铝搅伴,30克氧化铝(80~120目,I~III)装柱(1＊45),先加30毫升氯仿洗脱,再用氯仿和甲醇(99:1)混合溶剂洗脱.速度控制在1毫升/分左右,每10毫升收集一份,经薄层检识,将氧化苦参碱的流份合并,回收溶剂至干,用少量丙酮溶解,放置吸晶,得氧化苦参碱纯品,薄层检识后,干燥,侧溶点.

　　（2）苦参总碱0.1克进行低压柱层析

　　吸附剂:薄层用硅胶15克(已用NH4OH减活)

　　洗脱剂:CHCL350毫升,CHCL3-MeOH(98:2)100毫升,(95:5)100毫升,MeOH100毫升

　　流速1毫升/分10毫升收集一份.

　　5.氧化苦参碱的还原

　　取氧化苦参碱粗品1.0克,溶于15毫升10%盐酸水溶液中,放

　　入1.0克锌粉,室温放置,不时摇动,放置24小时后过滤,浓度调到PH=9~10,用500毫升乙醚分多次提取.合并乙醚溶液,无水硫酸钠干燥过夜,回收乙醚淡黄色粘稠体放置于冰箱中,得浅黄色固体,石油醚重结晶后得白色结晶,测熔点.

　　薄层检识

　　氧化铝干板(120目以上)

　　样品:苦参碱标准品,氧化苦参碱标准品,苦参碱

　　溶剂系统:氯仿:甲醇=8:2

　　显色剂:改良碘化铋钾溶液

　　附:阳离子交换树脂的处理

　　(1)预处理及转型:

　　将100克聚苯乙烯磺酸钠型树脂(交联度1~7%粒度范围

　　16~50目)放入烧杯中,用80℃蒸馏水温热使之充分膨胀1小时,后加入2N盐酸300毫升洗,水洗至PH5~7,5%NaOH浸泡1H?浸泡过夜(注意开始要搅动几次).次日把树脂装入层离柱,并使全部酸液流过树脂柱,用蒸馏水洗至中性至无氯离子反应为止,可用于无生物碱交换.

　　(2)再生

　　将已洗去生物碱的树脂,置渗滤筒中,加2倍的2N盐酸浸

　　泡过夜,次日树脂上面的盐酸慢慢流过树脂,用水洗至中性,然后用5%的氢氧化钠浸泡1~2小时,时常搅伴,倾倒出上层碱液,用馏水洗至中性,在空气中晾干,留作下一次使用.

　　四.思考题

　　1.酸水法及离子交换树脂法提取分离生物碱的原理.

　　2.应如何检查(1)渗滤液中是否含有生物碱?

　　(2)渗滤液中生物碱是否可以被交换在树脂上?

　　(3)离子交换树脂是否已达到饱和?

　　3.氧化铝薄层层析的原理是什么?适用于什么成分的分离鉴定?

　　4.当用硅胶薄层板层析时应如何操作?

　　五.参考文献.

　　1.江苏中医学院:中药大辞典上海人民出版社1977年

　　2.张宁芳:中草药通讯1977(1):38

　　3.中国医科院第五研究室:放射医学

　　4.白世泽等:中草药13(4);8.19821977(2):39.19771977(1):1.1977

　　5.ShigenobuOkuda:ChemPharmBull13:485.1965

　　芦丁的提取,分离及鉴定

　　芦丁(Rutin)亦称芸香苷（Rstinoside），广泛存在于植物界中，其中以槐米和荞麦叶的含量较高，可作为提取芦丁的原料。

　　槐花米系豆科植物，Sophorajaponica的花蕾，自古作为止血药。槐花米中所含主要成分芸香苷有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要为防止高血压病的辅助治疗药物。此外，芦丁对于放射性伤害所引起的出血症亦有一定作用。

　　一．实验的目的和要求

　　1．以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。

　　2．掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷，甙元和糖部分的鉴定方法。

　　3．通过？皮素紫外吸收光谱的测定及应用化学位移确定黄酮类烃基位量的方法。

　　4．通过？皮素与其五乙酰化合物的红外光谱测定该化合物的功能团并与标准谱对照。

　　二．槐花米中已知主要成分的理化性质：

　　槐花米中芦丁的含量可高达20％，另含少量的皂苷，皂苷水解后，可得到桦皮醇（BetulinC30H50O2）及槐二醇（Sophoradiol，C30H50O2）。

　　1．芦丁（芸香苷Rutin）

　　本品为淡黄色细小针状结晶，C27H36O16。3H2O，MP为177～178℃，无水物MP190℃（不完全），214～215℃发泡分解。芦丁溶于热水（1：200），难溶于冷水（1：8000）；溶于热乙醇（1：7），冷乙醇（1：100）；热乙醇（1：30）。冷乙醇（1：300），难溶于乙酸乙酯，丙酮，不溶于苯，氯仿，乙醚，及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。

　　2．？皮素（Quercettin）

　　即云香苷苷元，为黄色结晶，C13H10O7，MP313～314℃，无水溶点316℃。？皮素溶于热乙醇（1：23），冷乙醇（1：300）。可溶于冰醋酸，吡啶，乙酸乙酯，丙酮等溶剂。不溶于石油醚，苯，乙醚，氯仿和水中。

　　3．皂苷

　　易溶于水，吡啶，能溶于甲醇。经酸水解后得桦皮醇

　　及槐二醇，均溶于苯，乙醚，氯仿，丙酮，乙酸乙酯，乙醇，甲醇。

　　三．自槐花米中提取芦丁：

　　1．提取方法：

　　方法1：取槐花米40克（完整），置于100毫升烧杯中，用冷水快速清洗去泥沙等杂质沥干水，加0.4％硼砂水沸熔液400毫升,直火加热微沸,即时侧PH值,当PH数值改变成微酸性时,以石灰乳调至PH8,继续加热微沸30分钟,随时补充水份,同时保持PH8,静置约5~10分钟,倾出上清液,用尼龙布过滤,重复提取一次,合并滤液,将滤液用盐酸调至PH3左右,再加泥泊金,放置过夜,抽滤用水洗3~4次,空气自然干燥得粗芦丁.

　　方法2：取槐花米20克,置于500毫升圆底烧瓶中,加乙醇150毫升,加热回流1小时,稍冷后抽滤,滤渣再加乙醇100毫升回流1小时,合并乙醇提取液,放冷,析出絮状沉淀.过滤,滤液浓缩至50毫升,放置过夜,析出结晶,滤去母液继续浓缩一半,放置又析出结晶.合并结晶,用乙醚30~50毫升分次洗去脂溶性成分(油脂,叶绿素等),再用丙酮10毫升洗涤一次,得粗芦丁.

　　2．重结晶方法

　　方法一：取粗芦丁2克，加乙醇50～60毫升加热溶解，呈热抽滤，将滤液浓缩至20～30毫升，放置，析出结晶，母液再浓缩一半，又析出结晶。合并结晶再用乙醇重结晶一次。

　　方法二：取粗芦丁2克，加去离子水或蒸馏水400毫升，加热煮沸，趁热煮沸，趁热抽滤（以滑石粉助滤）；放置过夜析晶（或放冷析晶）。抽滤。得精制芦丁。思考题：提取芦丁工艺中影响产量和质量的因素是什么？为什么药加硼砂水溶液？

　　记录：粗芦丁得率多少？精制芦丁得率多少？溶点？

　　3．芦丁的水解

　　取芦丁1克，加2％H2SO480毫升，小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即？皮素，抽滤取结晶（保留滤液20毫升，以检查其中所含单糖），加50％乙醇（按1克90毫升量）加热回流使？皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置结晶，抽滤得精制品，在减压下110℃干燥可得？皮素无水物。测熔点，进行纸层析法鉴定。

　　思考题：芦丁水解不完全时将产生什么结果？

　　记录：芦丁的水解产物是什么？主要产物得率？溶点？

　　四．芦丁，？皮素，糖及？皮素衍生物的鉴定：

　　1．纸层析：

　　新华一号层析滤纸

　　样品：自制芦丁，？皮素

　　对照品：芦丁，？皮素

　　展开剂：（1）正丁醇－醋酸－水（4：1：5上层或4：1：1）

　　（2）25％醋酸水溶液

　　（3）85％醋酸水溶液

　　显色：（1）可见光下观察，再在紫外灯下观察

　　（2）经氨气熏后再观察

　　（3）喷三氯化铝试剂后再观察

　　2．芦丁和？皮素的聚酰胺薄层鉴定：

　　样品：同纸层析

　　展开剂：乙醇－水（7：3）

　　显色：同纸层析

　　3．糖的检出——纸层析法

　　取上述滤出？皮素时保留的水解滤液200毫升，加Ba(OH)2细粉（约2.ǚ克）中和至PH7,滤除生成的BaSO4沉淀(可用滑石粉助滤),滤液浓缩至1毫升,供纸层析法点样用.

　　展开剂：正丁醇－醋酸－水（4：1：5上层或4：1：1）

　　对照品：葡萄糖，鼠李糖水溶液

　　显色剂：苯氨邻苯二甲酸试剂喷后，105℃烘10分钟，显棕色或棕红色斑点。

　　4．红外光谱测定：

　　5．？皮素五甲醚的制备：

　　取？皮素结晶400Mg置于150毫升三颈瓶中，加50毫升无水丙酮，装上电动搅拌器，冷凝管及温度计，加热回流搅拌，每间隔一适当时间加入无水碳酸钾0.2克和硫酸二甲醇0.2毫升,大约1.5小时后加完4克无水碳酸二甲酮,继续加热回流搅拌直至溶液黄色完全消退为止,约需4~5小时,停止加热,取下烧杯,反应液经过滤,沉淀用热丙酮洗涤数次,合并系,滤液,蒸馏回收部分丙酮,留存10~15毫升,放置,渐渐析出无色结晶,表示过?的硫酸二甲酯存在,应加5%NaOH数滴,振摇使硫酸二甲酯水解,此时又可析出一小部分结晶(检查所析出结晶对1%FeCL3的反应,甲基化完全者呈负反应),合并,以乙醇重结晶,得?皮素五甲醚(MP152~153℃).甲基化不完全者时对三氯化铁出呈正反应,主要产品为3,7,3”,4”甲醚,MP161~161.5℃.

　　6．？皮素的降解

　　取？皮素50Mg，置于50毫升的圆底烧瓶中，加水50毫升，乙醇6毫升，KOH？，置水浴上加热回流10小时，蒸去乙醇，加水50毫升溶解，用稀盐酸酸化至PH2～3，用乙醚萃取3次，合并乙醚液，回收乙醚，蒸滞小体积供薄层层析点样用。

　　7．？皮素降解产物的薄层层析：

　　硅胶－CMC－Na薄层

　　对照品：原儿茶酸（Protocatechuicacid），间苯三酚9Phlorogluoinol)。展开剂：氯仿－丙酮－醋酸（8：2：0.5）

　　显色剂：三氯化铁试剂

　　思考题：

　　（1）芦丁和？皮素用不同展开剂系统展开层将出现什么结果？为什么？

　　（2）芦丁和？皮素聚酰胺薄层将出现什么结果？为什么？

　　（3）试比较？皮素红外光谱图和五酰基？皮素红外光谱图的差异。记录：

　　（1）芦丁和？皮素的纸层析，聚酰胺薄层层析结果。

　　（2）糖的检出纸层析结果。

　　8．紫外吸收光谱测定？皮素

　　（一）原理

　　利用紫外吸收光谱，测定黄酮化合物在加入各种电解质或络合剂后吸收峰的位移，根据位移的情况，以判断该化合物烃基的额位置。

　　（二）试剂配制

　　1．无水乙醇：用分析纯的甲醇，加入10％CaO，放置24小时后并加热回流1小时，回流时冷凝管顶端应安装CaCL2干燥管，然后蒸馏得无水甲醇。

　　2．甲醇钠溶液：取0.25克金属钠,剪碎,小心的加入无水甲醇50毫升中,放置24小时后全溶.

　　3．氢氧化钠溶液：取2.5克无水三氯化铝,加10毫升水溶解.

　　4．三氯化铝溶液：2.5克无水三氯化铝(呈黄绿色)小心的加入无水甲醇50毫升中,放置24小时后全溶.

　　5．醋酸钠：用水粉状醋酸钠。

　　6．硼酸饱和液：将无水硼酸加入适量无水甲醇，制成饱和溶液。

　　依照上述方法制备的贮备液可放置6个月。

　　(三)．测定方法：

　　１．酮烃基位置的测定：

　　精密称取黄酮样品（？皮素）约１.２mg，用无水甲醇溶解，在稀释至100毫升。

　　（1）黄酮光谱：取样品溶液约3毫升置于石英杯（1CM）中，在200～300nm波段内进行扫描。重测一次，视光谱的再现性。

　　（2）氢氧化钠光谱：取样品溶液约3毫升置于石英杯中，加入氢氧化钠溶液2～3滴立即测定。放置5分钟后，在进行测定。

　　（3）甲醇钠光谱：取样品溶液约3毫升置于石英杯中，加入甲醇钠溶液5～7滴后，立即测定。放置5分钟后，再进行测定。

　　（4）三氯化铝光谱：在盛有约3毫升样品溶液的石英杯中，加入三氯化铝溶液6滴，放置1分钟后进行测定。测定后，加入3滴盐酸溶液（浓盐酸：水＝1：1），再进行测定。

　　（5）醋酸钠光谱：取样品溶液约3毫升置于石英杯中，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀；杯底剩有2mm的醋酸钠后，二分内进行测定。

　　（三）测定结果：

　　？皮素加位移试剂结界表（）

　　加入试剂编号II峰I峰位移值羟基

　　无水甲醇1256371

　　NaOH2430I峰△594‘－OH

　　3，4‘－OHNaOH5‘2‘分解分解

　　MeONa3416I峰△453－OH

　　3，4‘－OHMeONa53‘分解分解

　　ALCL4270450I峰△793，5及3‘，4‘－OH

　　ALCL，／HCL4‘265425I峰△543，4‘－OH

　　NaAc5277387II峰△217－OH

　　NaOAc／H3BO36259385I峰△143，4‘－OH

　　克分子吸收系数的测定：根据已

　　测定的黄酮光谱，测量吸收峰的波长和吸收峰前后20nm的波长范围。然后取样品溶液约3毫升，置于1cm的石英杯中，用紫外光谱仪，仔细测量在上述波长范围内的各波长的吸收值，反复测定3次。

　　记录：

　　（1）位移测定结果

　　（2）测定克分子吸收系数皂吸收峰前后20nm波长范围内，依次测定波长和吸收值，用方格纸作图，精确的测出吸收峰的波长和吸收值，记录测定结果。

　　薄层层析应用

　　一.定性点滴反应

　　1.样品

　　(1).氨基酸混合液

　　(2).薄荷油

　　(3).芦丁甲醇溶液

　　(4)甘草次酸乙醇液

　　(5)原儿茶酸乙醇液

　　(6)小檗碱乙醇液

　　2.检出试剂

　　(1).三氯化铁1%乙醇溶液

　　(2).三氯化铝1%乙醇溶液

　　(3).茚三酮0.2%乙醇溶液

　　(4).碘化铋钾(见附录I)

　　(5).*香草醛-硫酸

　　(6)酸5%乙醇溶液.

　　3.实验方法.

　　取硅胶CMC-Na薄层板1~2块,用软铅笔按下图划线,构成方格,将各样品先滴加于相应的格子中,再将各试剂分别自空白其5逐点点加试剂,观察并记录反应变化.具腐蚀性试剂也可用空白磁板.

　　(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)

　　空白

　　(1)

　　(2)

　　(3)

　　(4)

　　*香草醛-硫酸为1克香草醛(Vanillin)溶于100毫升浓硫酸,或0.5

　　克香草醛溶于100毫升硫酸-乙醇(4:1)中,喷洒后用电吹风加热至120℃,观察颜色变化.0.5%硫酸-乙醇(4:1)溶液

　　二.鉴别中草药中的化学成分

　　1.单向展层

　　例一.（1）硅胶CMC-Na薄层(载玻片板)

　　(2)样品

　　（3）展开剂

　　②乙酸乙酯

　　③石油醚－乙酸乙酯（85：15）

　　（4）显色剂①石油醚薄荷油,薄荷脑的0.1%乙醇溶液香草醛－硫酸（压板法）

　　点样展层后，稍干，后扣在一块同样大小并涂布一层（不可多加，多了会使斑点扩散）显色剂的玻璃板上，压紧稍后一下，取除玻璃片，使薄层面向上，观察层面向上，观察颜色变化。由结果判断何种展开剂最适合分离薄荷油？例二．（1）硅胶CMC—Na薄层（载玻片板）

　　（2）样品四季青提取物

　　原儿茶碱（ProtocatechuicAcid）1％乙醇溶液

　　原儿茶碱（ProtocatechuicAcid）1％乙醇溶液

　　（3）展开剂

　　②氯仿

　　③甲醇

　　④氯仿：丙酮（8：2）

　　⑤氯仿：丙酮：甲醇：醋酸（7：2：0.5：0.5）

　　(4)显色剂三氯化铁1%乙醇溶液①石油醚

　　由展层结果判断选用何种展开剂为最合适?展开剂⑤中为何药

　　加醋酸。

　　2双向展层

　　（1）硅胶CMC-Na薄层板（8＊8cm），不活化。在薄层板距两边各1.5cm交点的地方点样品。

　　（2）样品？？氨基酸（精氨酸，脯氨酸，亮氨酸的1％水溶液）

　　（3）展开剂：第I向为正丁醇－醋酸－水（4：1：1）（V/V）

　　第II向为苯酚－水（75：25）（W/W）（苯酚需要蒸后使用）

　　第一向展开剂展层后，用热风吹使溶剂挥发，再将样品

　　已展层的一向作起始线，在第II向溶剂中展开。

　　（4）显色剂：0.2％茚三酮乙醇溶剂，喷洒后，以电吹风见加热（110℃）显色，

　　观察各斑点的颜色变化。最后喷洒2％硫酸》水溶液固色。

　　3．硝酸银－硅胶薄层

　　（1）硝酸银硅胶悬浮浆的制备（2.5％AgNO3制硅胶薄层）：用20克硅胶G和55毫升水中含5g硝酸银（8％）的溶液调制成，阿波常法捕薄层板（4＊7cm，约30块）。避光阴干后于105℃活化半小时避光储存备用。

　　（2）样品：1，龙脑2，香橙醇3，牛龙牛儿醇

　　二氮甲烷：氯仿：乙酸乙酯：正丁醇＝（3）展开剂：10％的硫酸乙醇液

　　45：45：4.5：4.5

　　（4）显色点：110℃加热

　　三．薄层板上原位化学反应

　　本法使直接在薄层板上进行的化学反应，又称原位反应薄层。先将样品滴加在薄层板上，然后滴上适当的溶剂展开反应物。有时先在试官内进行反应，而后在薄层板上进行层析检识。根据原化合物的Rf值再联系产物的层析行为，Rf值，可供鉴别一个化合物或者提供鉴定一个化合物有价值的线索。应用这些特殊反应只消耗未知物极微量的样品却提供了有关结构鉴别的信息，操作简便。如氧化，还原，脱水，水解，卤代，酶的催化作用，酯化，硝化，衍生物的制备，混合反应等均可在薄层板上进行。例：

　　１．酯化反应

　　（1）取原儿茶酸乙醇溶液，在一薄层板上点两个相同的样点，其中一份样点的原点上，再点加试剂：醋酸－吡啶（3：1），待溶剂挥发后，再重复点加试剂几次，干后，以氯仿－丙酮（8：2）展开。（用点蒸气熏显色，可见其中点加醋酐吡啶试剂的样点已展来在前，而未加试剂的样点仍在起始线）。两者Rf值不同的理由是：？

　　（2）取原儿茶醛乙醇，在同一薄层上点加两个相同的样点，其中一分样点的原点上，在点加酸酐－吡啶（3：1），待试剂挥散后，在重复点加试剂数次，用氯仿－丙酮（8：2）展层。用2，4二硝基苯肼显色，可显示加酰化剂前后样品点有什么变化。

　　２．成盐反应

　　取原儿茶醛乙醇溶液，在同一薄层板的起始线上点加2个相同样点，其中一份

　　样点的原点上，再点加10％碳酸氢钠溶液（另一份不加），以氯仿－丙酮－甲醇（8：2：1）展层，并用三氯化铁乙醇溶液喷雾显色，可见其中点加碳酸氢钠的样点Rf值已有变化，未加碱的样点照常展开。为什么？

　　３．苯氨反应

　　取原儿茶碱乙醇溶液，在同一薄层上点两个相同的样点，其中一份样点的原点上，在点加2，4二硝基苯肼试剂，给以热风以促使呈腙反应，然后以氯仿－丙酮（8：2）展层，可见出现两个棕红色斑点。在红棕色斑点下，再喷以三氯化铁试剂，又出现紫蓝色斑点。上面的红棕色斑点是原儿茶碱与2，4－二硝基苯肼所形成的胺，下面紫蓝色斑点是剩下的部分未成腙的原儿茶醛。2，4－二硝基苯肼的斑点呈黄色，Rf值最大。

　　由原位反应的结果判断原来化合物的结构上有何集团特征。并绘制出薄层层析图谱。

　　4化合物纯度的检测：

　　（1）化合物纯度的检查，可采用的方法测溶点，对纯品而言，溶点距1～2℃之间

　　（2）HPLC法显示一个主降按面积归一法，应.>95％

　　（3）薄层层析法，按药典规定制备薄层点样100μg展距17cm未见杂质斑点，操作同上，只是需配制一定浓度的检测液定量点样。

　　纸层析的应用

　　鉴别天然产物中的糖类,氨基酸等极性化学成分常被采用.

　　多缓冲溶液和碱性纸层析法的应用(原理属分配分离)

　　一.混合单糖的PC

　　(1).层析滤纸按纤维长丝方向(纵向)切成适当大小的纸条,在一端2cm处用铅笔划一条线为起始线，在起始线上点样，点样斑点的直径小于0.3cm，点间距1～1.5cm。

　　（2）样品：2.5％葡萄糖鼠李糖混合溶液

　　（3）展开剂：正丁醇－醋酸－水（4：1：1或4：1：5上层）

　　（4）显色剂：邻苯二甲酸－苯氨试剂*喷雾后于105℃加热10分钟。呈现桃色

　　或棕色。

　　记录：贴PC滤纸条

　　葡萄糖Rf：

　　鼠李糖Rf：

　　二．混合氨基酸的PC－阿胶水解液

　　（1）层析滤纸5*20cm一张，点样同上。

　　（2）样品：阿胶酸水解液，猪阿胶酸水解液

　　（3）展开剂：正丁醇：甲醇：水（15：3：2）

　　（4）显色剂：0.2％茚三酮乙醇液

　　记录：贴PC滤纸条

　　比较二种阿胶所含氨基酸是否一样

　　三．多缓冲液和碱性纸层析法

　　（一）蒽醌衍生物的分离

　　＊苯氨－邻苯二甲酸试液为苯氨0.93克和邻苯二甲酸1.66

　　克溶于100毫升正丁醇（用水饱和）中。

　　（1）缓冲滤纸的制备：取新华滤纸（3*12cm）一张，距下端2cm处划一起始线，向上面每隔1.5cm划一平行线按右图在各条带上图布PH缓冲液和碱液，然后将其夹在两片滤纸中吸至半？使润湿指数为1.5倍）备用。

　　（2）样品：大黄素（Emodin）大黄素甲醚（Physcion）芦荟大黄素（Aloe-emodin）大黄酸（Rhein）的氯仿溶液。

　　（3）点样：每隔2cm点样。

　　（4）展开剂：氯仿

　　（5）显色剂：荧光检出

　　（6）结果：记录图谱，并说明这些化合物的酸度。

　　［附］PH缓冲液的配置：

　　PH3：取0.2M磷酸氢二钠溶液4.1ml加0.1M柠檬酸15.89毫升配成。PH5：取0.2M磷酸氢二钠溶液10.30ml加0.1M柠檬酸9.70毫升配成。

　　PH8：取0.2M磷酸氢二钠溶液19.45ml加0.1M柠檬酸0.55毫升配成。PH9.9：取0.1MNaCO35ml加0.1MNaHCO35毫升配成。

　　0.2MNa2HPO4溶液含35.61克／升

　　0.1M柠檬酸溶液含21.01克／升

　　0.1MNaCO3溶液含28.62克／升

　　0.1MNaHCO3溶液含8.40克／升

　　（二）叔胺碱的分离：

　　（1）缓冲滤纸的制备：操作同上，配置五种不同的PH值的缓冲液，PH值分别为6.0，5.4，5.0，4.6，4.0。

　　（2）样品：粉防己甲素（Tetrandrine）粉防己乙素（Fangchinoline），轮环藤酚碱（Cyclonoline），粉防己总生物碱乙醇液。

　　（3）展开剂：氯仿

　　（4）显色剂：改良碘化铋钾

　　（5）结果：记录图谱，并说明这些生物碱的碱度强弱。

　　［附］PH缓冲液的配制：

　　PH4.0：取0.2MNa2HPO4溶液7.71毫升加0.1M柠檬酸溶液12.29毫升配成。PH4.6：取0.2MNa2HPO4溶液9.35毫升加0.1M柠檬酸溶液10.65毫升配成。PH5.0：取0.2MNa2HPO4溶液10.30毫升加0.1M柠檬酸溶液9.70毫升配成。PH5.4：取0.2MNa2HPO4溶液11.15毫升加0.1M柠檬酸溶液8.85毫升配成。PH6.0：取0.2MNa2HPO4溶液12.63毫升加0.1M柠檬酸溶液7.37毫升配成。

　　柱层析的应用

　　常压柱层析在中草药化学成分分离上的应用

　　低压柱层析在中草药化学成分分离上的应用

　　减压柱层析在中草药化学成分分离上的应用

　　干柱柱层析在中草药化学成分分离上的应用

　　一．常压柱层析：

　　1．四季青中酚性化合物（原儿茶酸，原儿茶醛）的分离

　　原儿茶酸（ProtocatechuicacidC7H6O4，3,4－二羟基苯甲酸）无色针晶，溶

　　点198～200℃。易溶于水乙醇乙醚丙酮醋酸乙酯，难溶于苯氯仿。

　　原儿茶醛（ProtocatechuicaldehydeC7H6O3，3,4－二甲基苯甲醛）；植物体内存在量少，不稳定，易氧化，熔点153～154℃

　　操作步骤：

　　（1）硅胶（100～160目，活度，Ⅴ级）6克，干法装柱。

　　（2）样品：5mg加洗脱剂5毫升加热溶解后过滤，用吸管吸取滤液加入柱顶。

　　（3）洗脱剂：石油醚／醋酸乙酯（4：6）。（先配50毫升，然后再酌量配）。

　　（4）收集洗脱剂：用小三角并收集每份10毫升（共收集10份）。

　　（5）检出：取硅胶CMC-Na小板一块如图画小格，用毛细管吸取各分洗脱液分别滴在各小格内，然后用毛细管取检出试剂*滴在检品处，观察结果，另一格子只滴出试剂进行空白对照。

　　试剂空白

　　样品＋试剂

　　试剂空白

　　样品＋试剂

　　*按醛的一般检验方法，采用2，4－二硝基苯肼对原儿茶醛形成肼呈橙色为正反应。

　　当检出洗脱液至无肼的橙色斑点出现时改用氨性硝酸银试剂检出原儿茶酸。当正反应时应使银－氨络离子的溶液中的银离子被原儿茶酸的邻二酚烃基还原成金属银呈黑色斑点反应。可加热促使分解。

　　从反应结果可判断出哪几个流份含有原儿茶醛，哪几份含原儿茶酸，或为空白流份。然后将这些流份分别浓缩后点样进行薄层层析检出，薄层层层析条件：硅胶CMC－Na薄层板。展开剂：氯仿：丙酮：甲醇：醋酸＝7：2：0.5：0.5

　　，显色剂：25的三氯化铁乙醇溶液显色，按展层结果合并相同流份，常压回收洗脱液至小体积，抽松后用乙醇为溶剂重结晶。抽滤得晶体，取少量晶体以少量乙醇溶解后再进行薄层层析，展层，观察是否为单体，就可以测熔点进行初步鉴定。已知或合物可作红外吸收光谱图与标准图谱对照证明。

　　记录各流份的点滴反应，薄层层析的结果（绘出图谱），写出所得单体的熔点数据。以初步判断所得化合物是什么化合物？

　　2．穿心莲中二萜内酯化化合物（穿心莲内酯，新穿心莲内酯）的分离。。。。。。。穿心莲内酯（AndrographolideC20H30O6穿心莲乙素），无色方形或长方形结晶，熔点230～231度，。。。味极苦。可溶于甲醇，乙醇，丙酮，吡啶中，微溶于氯仿乙醚，难溶于水及油醚。

　　新穿心莲内酯（Neo-andrographolideC26H40O8穿心莲丙素穿心莲新甙）无色柱状结晶，熔点168～169度。。。。。。苦味，可溶于甲醇，乙醇，丙酮，吡啶，微溶于氯仿和水，不溶于乙醚和石油醚.

　　操作步骤:

　　取中性氧化铝(100~200目,加入8%水振摇均匀使活度呈6级)6克(按样品:吸附剂=1:300量),先加入二氯甲烷,并打开柱下口活塞,湿法装柱.

　　取穿心莲内酯为主的精制品20mg置于蒸发皿内，用刮刀压碎后加0.4ml的甲醇溶解，再加入中性氧化铝半牛角勺（约0.3g）拌匀后再红外灯下干燥，并用刮刀亚成散粒，然后加到柱顶，呈均匀薄层带。将一滤纸片（直径小于层析柱的内径，滤纸片打小孔，平铺在样品层上。首用洗脱剂要保留柱顶）。

　　按梯度洗脱，先以二氯甲烷洗脱，用小三角瓶收集洗脱液，硅胶板上检查内酯成分出现时开始（用毛细血管滴下的洗脱液点在硅胶的薄层板上，用Kedde试剂检出，加热后出现紫色斑点）收集第一流份，每流份收集10ml。继以二氯甲烷：无水乙醇＝20：1洗脱，再改为二氯甲烷：无水乙醇＝9.6：0.4洗脱，再以甲醇洗脱，最后用50％甲醇洗脱。分别浓缩各馏份至小体积。然后每份点样于硅胶CMC-Na板上，并用对照品（穿心莲内酯，新穿心莲内酯）对照，展开显色条件：硅胶CMC-Na板，氯仿／甲醇（10：1）展开，Kedde试剂（3，5～二硝基苯甲酸碱性试液）喷雾，加热后显紫红色斑点，从TLC结果检查样品究竟含有几个穿心莲二萜内酯类化合物？记录TLC图谱结果。

　　说明：

　　柱层析时所用的仪器要干燥：

　　层析柱

　　杯

　　吸管

　　皿

　　小漏斗

　　筒

　　玻棒

　　筒15只1支小三角烧1支1只1只1只1只1只量蒸发量

　　二：低压柱层析

　　1．大黄酚大黄素甲醚大黄素的分离

　　大黄素（Emodin），橙黄色长针晶（丙酮）

　　mp。255～257度，能升华。几乎不溶于水，能溶于乙醇，可溶于Na2CO3NH4OH和NaOH水溶液。溶解度（g/100ml）乙醚0.14，氯仿0.071，苯0.041，四氯化碳0.01（25度）。

　　大黄酚（Chrysophanol），金黄色六角形片状结晶（丙酮结晶）或针状结晶（乙醇）溶出？？？mp。196度，能升华。几乎不溶于水，微溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，可溶于苯，氯仿，乙醚，丙酮，冰醋酸，NaOH及热NaCO3溶液，不溶于NaHCO3Na2CO3水溶液，难溶于石油醚。

　　大黄素－6－甲醚（Physion），橙黄色针晶。Mp207度，能升华。溶解性与大黄酚相似，可溶于NaOH水溶液。

　　操作步骤：

　　（1）薄层层析用硅胶H10克，湿法装柱。

　　（2）样品：总蒽醌粗品约5mg,加少量丙酮恰溶解后，在取少量硅胶拌合均匀，在红外线灯下红干，上柱。

　　（3）洗脱剂：石油醚／醋酸乙酯（9：1），（8：2），醋酸乙酯，乙醇。

　　（4）收集洗脱液：视色带情况，收集每流份的量。

　　（5）压力：N20.5kg/cm2

　　（6）浓缩每流份至小体积。

　　（7）检查：

　　TLC：石油醚／醋酸乙酯（9：1）

　　PC：石油醚以水饱和

　　对照品：大黄素

　　液。大黄酚大黄素－6－甲醚乙醇溶

　　显色：可见光下显亮黄色斑点。

　　紫外分析灯下显亮黄色斑点

　　氨熏显红色斑点

　　3％NaOH溶液或Na2CO3溶液喷后现红色斑

　　点。

　　记录：TLC，PC结果，附图谱，检查每组分样品的纯度。

　　2．粉防己甲素和粉防己乙素的分离：

　　（1）粉防己甲素

　　无色针状结晶，mp。217～218度。。＋297度（C1,CHCL3）。其盐酸盐MP。263度（较）266度（分解），其苦味酸盐MP。247度，》》＋286.7度（CHCL3），碘化二甲酸粉防己甲素（汉肌松，C40H48O6N2.I2）无色鳞片状结晶，mp。258～260度。。。＋185度（MeOH）。粉防己甲素不溶于水，石油醚，易溶于乙醇甲醇丙酮氯仿和苯中，也溶于稀酸水溶液。

　　（2）粉防己乙素：

　　所拥溶剂不同，结晶熔点不同。吡啶－甲醇中结晶，mp.121~122度；丙酮中结晶，六面体粒状结晶mp134～136度；甲醇中结晶，细棒状体mp.177～179度；乙醇中结晶，细棒状，mp.241~242度。。＋275度（C

　　其苦味酸盐mp。186度0.57，CHCL3）。，。。。溴化二甲基粉防己乙素（汉松敏，

　　C39H46O6N2Br2）无色针状结晶相似，极性较粉防己甲素稍高，故在苯中的溶解度小于甲素，而在乙醇中的溶解度大于甲素，借此可以相互分离。

　　操作步骤：

　　（1）薄层层析用的硅胶H20克，先用少量氨水饱和，湿法上柱。

　　（2）样品：粉防己生物碱的粗品10mg，加适量CHCL3溶解，然后用少量硅胶

　　拌合均匀，在红外线灯下烘干，上柱。

　　（3）洗脱剂：氯仿／甲醇（9：1），（8：2），（7：3），（6：4）—————》甲醇。

　　（4）检出试剂：碘化铋钾试剂

　　（5）收集：每流份10ml量

　　（6）压力：N20.5kg/cm2

　　（7）浓缩每流份至小体积

　　（8）检查：

　　硅胶CMC-Na

　　展开剂－－氯仿／乙醇（10：1）或（10：0.7），氨气饱和氯仿／丙酮／甲醇（4：5：1），氨水饱和。

　　显色剂——改良Drogendorff试剂

　　对照品——粉防己甲素乙醇液

　　粉防己乙素乙醇液

　　（9）记录：TLC结果，附图谱，检出每组分样品的纯度。

　　三．减压柱层析（VLC）（VacuumLiguidChromatography）

　　C20二萜生物碱hetisine和hetisinone的分离

　　操作步骤：

　　（1）VLC柱（15ml量垂熔漏斗）

　　（2）中性氧化铝5克

　　（3）样品：hetisine16mg,hetisinone16mg

　　（4）洗脱剂：甲苯／甲醇3～5％，甲苯／甲醇6～8％

　　（5）检查：TLC，mp，IR

　　碘熏显色

　　Hetisinemp。254～258度

　　丙酮／甲醇中重结晶

　　Hetisinonemp.267~269度

　　丙酮中重结晶

　　四．干柱层析法

　　从华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.etwils中分离五味子酯丁五味子酯丁（SchisantherinD）

　　操作步骤：

　　（1）层析用酸性氧化铝（120～200目，3～6级）240克，装于直径2.5cm＊40cm的聚乙烯薄层膜柱中。

　　（2）样品1.4克溶于10毫升苯／醋酸乙酯（6：1）中，溶液加样。

　　（3）苯／醋酸乙酯（6：1）展层至柱顶。

　　（4）按TLC的Rf值推算带位置，也可以将一个展带再分成头，中，尾三段。用刀片切成段。

　　（5）各段分别置于适当的层析柱内，以醋酸乙酯洗脱，分别浓缩。

　　（6）TLC检查纯度

　　酸性氧化铝板（3～？级）

　　苯／醋酸乙酯（6：1）

　　碘蒸气显色

　　离心薄层层析的应用

　　大黄素－6－甲醚

　　丹参色素的分离：

　　一．利用离心薄层层析法分离大黄酚，大黄素－6－甲醚

　　大黄酚大黄素－6－甲醚二化合物极性相近，相互分离较为困难，有人曾采用磷酸钙柱层析，以石油醚展来，下层黄色带洗脱后以甲醇重结晶可得大黄酚，上层黄色带洗脱后以甲醇重结晶可得大黄素－6－甲醚。但较费时，使用洗脱剂量大。本实验利用LBC－3型离心薄层层析仪快速分离大黄酚和大黄素－6－甲醚。操作步骤：

　　（1）常规方法于转子上涂以1mm厚的硅胶G-CMC-Na（25～30g青岛海洋化工厂生产的硅胶G加入80～100ml0.4％CMC-Na水溶液，在乳钵中调匀辗磨成浆糊状）制备而成，阴干（约24小时）于70～90度的烘箱中活化2H，然后用1mm的刮板器修整转子备用。大黄酚的分离

　　（2）将制备好的转子装于LBC-3型离子薄层层析仪上，装样前，薄层转子先用洗脱剂预洗使洗脱剂达到饱和并除去硅胶中的杂质。

　　（3）取大黄酚大黄素－6－甲醚的混合物15mg溶于1ml氯仿中，用2ml的注射器吸取0.5ml直接进样（先启动转子），使样品在转子内形成窄带。

　　（4）用石油醚（或环己烷）：醋酸乙酯（25：1）洗脱（可借助于流量计控制）以1.5ml／min的流速送入，每收集2～4ml为一流份，以硅胶TLC检测每一流份。合并相同，回收，纯化，以TLC和mp检查纯度？计算回收率？

　　（5）检测条件：

　　TLC：石油醚（30～60度）：醋酸乙酯（9：1）

　　PC：石油醚以水饱和

　　显色方法：

　　可见光下显黄色斑点

　　紫外线下显亮黄色斑点

　　氨熏，显红色。

　　3％NaOH溶液或Na2CO3溶液喷后现红色

　　二．丹参色素的分离

　　丹参色素多为橙色，红色至棕红色的化合物，少数为为黄色。这些化合物极性相似，采用一般的柱层析方法较难分离得到单体。

　　本实验采用离心层层析的技术进行分离

　　操作步骤：

　　（1）硅胶CMC-Na离心薄层板（1mm厚）、

　　（2）总丹参醌混合物20毫克溶于2毫升氯仿，用注射器进样，使在转子内源形成均匀窄带图。

　　（3）洗脱剂：环己烷／醋酸乙酯（99：1）（98：2）（97：3）。。。。。1.5ml／min

　　（4）收集：按色带情况收集洗脱液。

　　（5）检查：TLC

　　硅胶G-CMC-Na板

　　展开剂：石油醚／醋酸乙酯（9：1）

　　可见光下观察色斑。

　　（6）记录：TLC结果。

　　掌叶防己碱的提取及其衍生物的制备

　　掌叶防己碱，又称巴马汀（Palmatine），硫酸延胡索乙素又称消旋四氢巴马汀硫酸盐（dl-telrahydropalmatinesulphate）.

　　延胡索乙素（CoryadalisB）为镇痛安定药,用于缓解胃肠系统的疾病所引起的疼痛，临产阵痛，头痛，失眠等。用延胡索乙素为主要药物制成的药物制剂有“元胡止痛片”等。

　　13－甲基巴马汀（13－methylpalmatine）,又称去氢紫？碱（dehydrocorydaline）,或去氢延胡索甲素，临床可用于治疗冠心病和胃溃疡等症。用其为原料制成的药物制剂有“可达灵片”等。

　　中药延胡索（元胡，CorydalisyanhusuoW.TWang）的块根属？？牡丹科紫堇属植物，其主要镇痛有效成分为去氢紫堇碱，氮其含量很少，为扩大药物资源，可用某些植物含其脱氢化合物巴马汀较多的特点，将其中的巴马汀提取后，再经氢化反应，制备延胡索乙素，或经化学结构的改造，将巴马汀转化为13－甲基巴马汀，以供临床应用。再中国华南一带的防己科天仙藤（FibraurearecisaPaerre）的根茎即为一种巴马汀含量较多的植物。

　　黄藤层例入《本草纲目》，现代民间作为清热消炎药，常用于治疗外伤感染，扁桃体炎，咽喉炎，结膜炎，热痢及黄豆等。

　　一．实验目的和要求：

　　1．掌握季铵生物碱的特性及其一种提取方法。

　　2．熟悉生物碱沉淀反应的条件和方法

　　3．掌握制备生物碱结晶性盐的方法和精制

　　4．掌握四氢巴马汀的制备方法。

　　5．熟悉巴马汀转化为13－甲基巴马汀的过程，认识生物碱结

　　构改造的重要性。

　　二．黄藤中已知成分的理化性质：

　　黄藤根茎及根中所含成分主要为巴马汀，还含少量药根碱伪非洲防己碱黄藤素甲黄藤素乙内酯及甾醇。又谓再根茎根及树皮含小檗碱。

　　1．掌叶防己碱（巴马汀，Palmatine）

　　本品是季铵原小檗碱型生物碱，溶于水乙醇，几乎不溶于氯仿乙醚苯等溶剂。掌叶防己碱盐酸盐即氯化巴马汀（PalmatineChloride）C21H22O4N.I.2H2O为橙黄色针状结晶。

　　UV

　　2．药根碱（雅脱碱，Jatrorhizine）

　　本品是具酚羟基季铵原小檗碱型生物碱，其理化性质与巴马汀相似，但较容易溶于柯性碱液中，其盐酸盐再水中的溶解度也比盐酸巴马汀大，可皆此性质分离。药根碱盐酸盐为铜色针状结晶，mp.204～206度，其苦味酸盐为呈黄色柱状结晶，mp.217～220度（dec.），其分子式为C20H20O4N。

　　3．小檗碱（黄连素，Berberine）

　　本品是季铵原小檗碱型生物碱，其游离碱为黄色长针结晶，C20H18O4N.OH.51／2H2O，mp.145度，在100度干燥，失去结晶水而转成棕黄色，小檗碱能缓缓溶于水（1：20），乙醇（1：100），较易溶于热水，热乙醇，热甲醇，微溶于丙酮，氯仿，苯，几乎不溶于石油醚中，小檗碱与氯仿丙酮苯均能形成加合物。小檗碱盐酸盐C20H18O4N.CL.H2O，mp.205度（dec），微溶于冷水，较易溶于沸水，其硝酸盐及氢碘酸盐，极难溶于水（冷水约为1：2000）。小檗碱的中性硫酸盐，磷酸盐，醋酸盐在水中溶解度较大。小檗碱的盐类在水中的溶解度：

　　盐酸小檗碱

　　硫酸小檗碱1：5001：30（酸性盐1：100）

　　枸橼酸小檗碱1：125

　　磷酸小檗碱1：15

　　4．伪非洲防己胺碱（Pseudocolumbamine）

　　本品为具酸羟基的季铵伪原小檗碱型生物碱，额能溶于水，乙醇甲醇，不溶于乙醚苯等溶剂。其C20H20O4N.CL.2H2O呈黄色短针晶，mp.>300度（del）

　　5．四氢巴马汀（Telrahydropalmatine）

　　元胡索乙素为消旋四氢巴马汀，是叔胺原小檗碱型生物碱，其游离碱

　　C21H25O4N，mp.146～148度，不溶于水，能溶于热乙醇（在冷乙醇中溶解度较小），易溶于氯仿苯乙醚中。元胡索乙素的酸性硫酸盐为无色针状结晶，mp.245～246度，在冷水中溶解度较小，在热水中较大，其中性硫酸盐为长柱状结晶，mp.220度，在水中溶解度较酸性硫酸盐为长柱状结晶，mp.270度，在水中溶解度较酸性硫酸盐为大，其盐酸盐难溶于水。

　　左旋四氢巴马汀即为颅痛定（Rotundine）mp.141~142度

　　6．各种原小檗碱型生物碱的紫外谱图特征如下所示：

　　三．巴马汀提取及延胡索乙素制备的方法

　　巴马汀为季铵生物碱，溶于水和极性大的有机溶剂（如甲醇乙醇），所以可用甲醇，乙醇或水进行分离。巴马汀是有机碱，尽管它带正电荷，但和水的

　　TCL展开剂的选择及显色剂的总结

　　选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚

　　Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/CH2Cl2,ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate

　　展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。

　　一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的

　　溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。

　　很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

　　我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合衡量！

　　溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。

　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用干法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）

　　来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水性溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。

　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附性强。

　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的性能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。

　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

　　（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。

　　1．薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。

　　2．吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。

　　3．展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。

　　显色剂：

　　1、碘：适用于不饱和或者芳香族化合物

　　配制方法：在100ml广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。

　　或者在瓶中，加入10g碘粒，30g硅胶

　　2、高锰酸钾：适用于含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛

　　配制方法：1.5gKMnO4+10gK2CO3+1.25mL10%NaOH+

　　200mL水.使用期3个月

　　3、磷钼酸(PMA)：广谱

　　配制方法：10gof磷钼酸+100mL乙醇

　　4、紫外灯：适用于含共轭基团的化合物，芳香化合物

　　5、硫酸铈：生物碱

　　配制方法：10%硫酸铈(IV)+15%硫酸的水溶液

　　6、氯化铁：苯酚类化合物

　　配制方法：1%FeCl3+50%乙醇水溶液.

　　7、桑色素(羟基黄酮)：广谱,有荧光活性

　　配制方法：0.1%桑色素+甲醇

　　8、茚三酮：适用于氨基酸

　　配制方法：1.5g茚三酮+100mLof正丁醇+3.0mL醋酸

　　9、二硝基苯肼(DNP)：适用于醛和酮

　　配制方法：12g二硝基苯肼+60mL浓硫酸+80mL水+200mL

　　10、乙醇：香草醛(香兰素)、广谱

　　配制方法：15g香草醛+250mL乙醇+2.5mL浓硫酸

　　11、溴甲酚绿：适用于羧酸，pKa<=5.0

　　配制方法：在100ml乙醇中，加入0.04g溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M的NaOH水溶液，刚好出现蓝色即至。

　　12、钼酸铈：广谱

　　配制方法：235mL水+12g钼酸氨+0.5g钼酸铈氨+15mL13、浓硫酸：茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1、广谱

　　配制方法：135乙醇+5mL浓硫酸+1.5mLof冰醋酸+3.7mL茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀.

　　14、茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2：适用于萜烯，桉树脑(cineoles),withanolides,出油柑碱(acronycine)配制方法：茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80)经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整