五加前胡素含量薄层层析法（TLC）检测试剂盒

　　五加前胡素（steganacin）含量薄层层析法（TLC）检测试剂盒

　　一、检测原理

　　五加前胡素（steganacin）含量薄层层析法（TLC）检测试剂盒由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。 根据Lambert-Beer定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。在适当的介质中，生物碱类药物可与氢离子结合生成生物碱阳离子，一些酸性燃料如溴百里酚蓝、溴酚蓝等可解离成阴离子，而上述阳离子与阴离子定量结合成有机络合物，即离子对。可以定量的用有机溶剂提取，在一定的波长处测定该溶液有色离子对的吸收度，即可计算出生物碱的含量。也可将呈色的有机相经碱化，使与有机碱结合的酸性染料释放出来，测定其吸收度。再计算出碱性药物的含量。

　　二、样品收集、处理及保存方法

　　1.样品的采集与制备chapman(chapman,H.D1966 Dignostic Criteria for plants and soils,Univ.of Calif.Berkeley)的采样技术得到普遍承认，可供参考。植物微量元素分析样品的干燥和粉碎过程中，所用方法与分析常量元素样品相似，特别指出的是防止干燥和粉碎过程中仪器对样品的污染。例如干燥箱中烘干时，防止金属粉末等的污染，粉碎样品选用的研磨设备，应采用不锈钢工具钢刀和网筛，如要准确分析铁，必须在玛瑙研钵上研磨，研磨分析标本的细度相当重要，至少通过20目筛，并充分混合，磨细过的样品，要贮存在密封的容器中，在分析前，样品应在60—70℃下烘干20小时，然后再进行分析。

　　2.血浆的制备 在采血器内加入适量的抗凝剂，采血后，反复颠倒采血器，使抗凝剂与血液充分混匀，静置或经过离心使血细胞下沉后，上清液即为血浆。 血清的制备 首先将采集的血液样品置室温半小时，待血液凝固后 2000—3000r/min离心5—10min，上清液即为血清；如离心后 有轻微的溶血，用牙签将血凝块挑出，将混有红细胞碎片的血清再次离心，用于净吸管收集血清于干燥的指型管中，贴上标签备用。如血清溶血严重，应剔出样品。 全血的制备 全血制备与血浆制备基本相同。供全血分析时，抗凝剂选用会直接影响化验结果，选用抗凝剂的原则：主要用于血液 pH值和血液电解质测定的应选用肝素；主要用于血液促凝时 间的测定应选用柠檬酸钠；主要用于血液有形成分检查的全血应选用EDTA；草酸盐不能用作血小板计数和尿素、血氨、非蛋白氨等含氨物质的检测。

　　三、操作方法

　　诱导剂检测

　　1． 准备好待测的纯化线粒体样品

　　2． 移取20微升线粒体样品（总量为200微克）到96孔酶标板的对应孔里

　　3． 加入10微升A混匀

　　4． 室温下静置1分钟

　　5． 即刻加入B或用户自备的待测诱导剂，混匀（注意：可以设定 不同浓度梯度）

　　6． 即刻放进分光光度仪（波长540nm或440nm）：获得0分钟和设定时间实际吸光值（A）―― 吸光值（A）降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

　　7． 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间实际吸光值/0分钟吸光值―― 吸光值比值降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

　　8． 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为时间（秒）

　　抑制剂检测

　　1． 准备好待测的纯化线粒体样品

　　2． 移取20微升线粒体样品（总量为200微克）到96孔酶标板的对应孔里

　　3． 加入10微升室温预热的A混匀

　　4． 加入10微升C或用户自备的待测抑制剂，混匀（注意：可以设定不同 浓度梯度）

　　5． 室温下静置2分钟

　　6． 即刻加入10微升B混匀

　　7． 即刻放进分光光度仪（波长540nm或440nm）：获得0分钟和设定时间实际吸光值（A）―― 吸光值（A）降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

　　8． 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间实际吸光值/0分钟吸光值―― 吸光值比值降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

　　9． 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为时间（秒）

　　四、其他备注

　　1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R 值，大于等于0.9900。

　　2. 灵敏度：最低检测浓度小于1.0 ng/mL。

　　3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

　　4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。